生物化学与分子生物学

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1、生物化学与分子生物学 实验技术目 录前言 第一章：生物化学与分子生物学中的定量分析 第二章：生物大分子的提取、沉淀和离心分离 第三章：层析技术 第四章：电泳技术 第五章：分子生物学基本技术前 言20年代：微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的 发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心 技术的理论基础，1924年制成了第一台5000 RCF的 离心机（5000 r/min-8000 r/min，相对离心力 “RCF”的单位可表示为“g”)，并准确测定了 血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的 诺贝尔化学奖。1. 1 生物化学实验技术发展简史30年代：电子显微镜技术打开

2、了微观世界，使我们能够 看到细胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授 建立了不少生物化学常用的分析方法如血糖分析、 蛋白质含量分析、氨基酸测定等。 英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了 三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出 了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共 获1953年诺贝尔生理医学奖。40年代： 两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱 （层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此 ，层析技术成为分离生化物质的关键技术。电泳技术由瑞典的著名科学家Tisellius奠基， 从而开创了电泳技术的新

3、时代，他因此获得了1948年 的诺贝尔化学奖。层析技术和电泳技术用于分析生物大分子的组成 和代谢的中间产物，示踪技术的应用推动了代谢的研 究。美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质空间结构 中以及生物大分子间相互作用的重要性等，并因此而 获得了诺贝尔化学奖。50年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水 化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，射性同位素示踪技术50年代有了 大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。1953年美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNA分子反向平行双螺 旋模型，1962年与英国科学家W

4、ilkins分享诺贝尔生理医学奖， Wilkins和 Franklin通过对DNA分子的X-射线衍射研究为Watson和Crick的DNA模型提供 了有力的实验证据， DNA双螺旋模型的提出开创了生物科学的历史新纪元。 在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X- 射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子立体 结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的顺序而获 得1958年的诺贝尔化学奖。 Kornberg发现了DNA聚合酶，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的 多核

5、苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译 成蛋白质的过程。两人分享了1959年诺贝尔生理医学奖。60年代： 各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技 术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快 了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析仪，到 1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动分析仪，又大大加快了对多肽 一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完 善。在60年代，层析和电泳技术又有了重

6、大的进展，在1968-1972年 Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的相对分子质量，使电泳技 术取得了重大进展。美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献， Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构 均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana提出按预定的序列合成核酸分子的 方法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA 等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺

7、贝尔生理医学奖。70年代：基因工程技术取得了突破性的进展，Arber， Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内 切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次 用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分 子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen 等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年 被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的 创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展 时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展 ，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。 80年代基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑 桥大学的生物化学家Sang

8、er和美国哈佛大学的Gilbert分别 设计出两种测定DNA核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝 尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物 学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研 究方面都作出了杰出的贡献。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电 泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于 生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学 科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验 技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于 HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和 下游技术。198

9、4年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein 和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善 了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学 奖。 1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发 明了用PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚 合酶链式反应扩增DNA的技术，对于生物化学和分子生 物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设 计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世 纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺 贝尔生理医学奖。1989年，美国科学家A

10、ltman和Cech由于发现某些 RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。90年代：1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在 断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发 现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝 尔生理医学奖。1995年，美国科学家Lewis、德国科学家 Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在 20世纪40-70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发 育基因而共享诺贝尔生理医学奖。进入21世纪以来，PCR技术、生物芯片技术不 断完善，基因组学、蛋白质组学、生物信息学发 展

11、迅速。我国生物化学界的主要成就我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初 由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张 昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化 检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。 1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界 上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素 ，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核 糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白 质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩 目的研究成果。90年代以来，我国参与了人类基因组计划， 在水稻基因组研究中处于国际领先水平，在功能 基因组学研究中取得不少成绩。1.2 生化实验室的基本设施与装备 温度与

12、环境设施许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进 行操作，因此，一个正规的生化实验室必须能够保 持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室 都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保 持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥 箱中。由于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要 求在不同的温度下保存，实验室必须备有4、 20、80的冰箱，需要在更低温度下保存的样 品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行的 操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备 有干冰，以便使用乙醇-干冰浴进行样品的快速冷冻 分装。 实验室用纯水生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用 试剂不能用自来水，只能使

13、用经过纯化的水。生化实验对所 用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量越高 ，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水 的质量。常用的两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯 分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如无菌水、亚沸 蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。根据实际工作的需要，来选 用水的种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚 沸蒸馏水及按特殊要求制备的高纯水等。所有的各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产 生有紫外吸收的有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子的 污染；长时间放置更会使水长菌，空气中的二氧化碳会溶入 水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时

14、 贮存在冰箱的冷藏室中。消毒系统生化实验要进行生物培养和生物反应的操作 ，这些操作都必须排除其他生物因素的干扰，因 此在做这些实验之前，都必须对实验中用到的、 可能造成污染的材料、器械等进行消毒灭菌处理 。常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线 照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消 毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。 离心设备离心方法是分离和制备生物大分子最常用的 手段，因而生化实验室必须备有各种形式的离心 机。常用的有普通台式离心机、高速冷冻离心机 和超速离心机等。 计量系统生化实验都要求在各种标准的定量条件下进行，因此实验室必须 配备各种标准的定量系统。常用的定量系统有：称

15、量系统、液体体积度 量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。 称量仪器：最常用的设备是各种千分之一的扭力天平、单、双 盘天平和各种万分之一的电子天平等，它们分别用于各种缓冲液的配制 和标准物质的称量等。 液体体积度量仪器：常用的有各种量筒、移液管、容量瓶、微 量进样器和各种自动取液器等。 酸碱度pH测量仪器：最常用的是pH试纸和pH计。 液体溶质定量仪器：此系统主要是根据液体溶质的某些理化特 性而设计的，不同的物质在一定的条件下有特定的吸收光谱，其吸收值 的大小与其在溶液中的浓度有一定的关系，可以通过测定某物质在溶液 中的吸收光谱来计算出该物质的浓度，因而分光光度计就是生化实验室 必备的仪器

16、分析手段。主要有可见分光光度计和高档的快速扫描紫外可见分光光度计等。 电泳装置电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一， 主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源 和电泳槽两部分组成，详见第4章。 层析系统层析又称为色谱，是分离各种生物大分子的主要手 段之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化 实验室最常用的仪器设备。主要的层析技术有：吸附层 析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见 第3章。 PCR仪PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶链式 反应。该反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段的 一种方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作的一种 仪器，是生化与分子生物学实验常用和必备的设备。 生物培养设施生物培养是生化实验必不可少的设备。生物材料的培养有微生物培养、植物细胞及组织培养、动物细胞及动物培养 等。不同的培养，其对设施的要求也有所不同。微生物培养：需要恒温恒湿培养箱、振荡培养器即摇床 （有空气和水浴式以及全温式摇床）、发酵罐、大型生物反