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1、军团菌及其检测技术武汉市疾病预防控制中心微生物检验科赵滢 博士EMAIL：2014年11月武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌的发现l 1976年7月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中爆发了一种症状相同，原因不明的细菌性肺炎， 有221人感染疾病，其中死亡34人。l 初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空气传播，采集标本，分离病原体l 革兰氏阴性杆菌嗜肺军团菌（L. pneumophila ）l 军团菌病 (已知的首次爆发)武汉市疾病预防控制中心微生物检验科Part I：军团菌及军团菌病武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径 0.30.5m，长
2、约1.25m或更长 ，菌体一端有鞭毛.在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通常需要在37 5%CO2培养箱培养2-10天。生长形成的菌落一般呈白色，也可能 会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻 花玻璃样，具有多型性.武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌科、属、种、血清型u军团菌科 (Legionellaceae ）Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei u军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系亚群中， 军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiel
3、la burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细 胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。u军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型 （serogroups)，至少有20个种可引起人感染。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella parisiensis 1985Legionella londi
4、niensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghensis 1980Legionella steigerwaltii
5、 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 1999Legionella wadsworthii 1983Legio
6、nella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gresilensis 2001Legionella cherrii 1
7、985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei 1992军团菌种武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌病武汉市疾
8、病预防控制中心微生物检验科Part II：样本的采集与运输武汉市疾病预防控制中心微生物检验科哪些环境中存在军团菌？武汉市疾病预防控制中心微生物检验科标本的种类u 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水；u 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科环境标本采集原则 最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水样，该水样即代表设备内的水。 过后流出的水标本：最初流出的水标本收集以后，让设备内的水流掉后再采集水样。此水代表供给设备的水。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科环境标本采集 有杀生物剂时的采样：水样中含有氯或其它氧化性杀生
9、物剂时，向采样瓶中添加适量硫代硫酸钾使其灭活。对于其它的生物剂，加入普通的中性试剂是无效的。 注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的间隔时间控制在14天以内。样本的来源，数量，有无杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。不知来源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科常见几种系统采集部位冷水系统的采集：进水系统蓄水池与每个蓄水池相连的下水道的排出口蓄水池最远的下水道的排出口对每一个装置来说，收集500ML最初流出的水标本，让水持续流，并在流水中放一只温度计，待温度稳定后，收集500ML过后流出的水标本。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科热水系统加热器
10、的排出口：选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备关掉离加热器最近的冷水系统。避免冷热水混合加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥排水口连接一根干净的硅胶管采样方式：打开开关采集最初流出的水标本。让水排掉至温度稳定为止。再采一份过后流出的标本，并关闭开关武汉市疾病预防控制中心微生物检验科淋浴器 收集最初流出的水标本 如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的未用过的塑料袋，该装置包裹起来，切掉一个角，将该切口处置于接取标本容器的开口处武汉市疾病预防控制中心微生物检验科冷却塔警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉冷却塔的鼓风机。戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器继续运
11、行而不能关闭冷却塔时，则需要采样人员做出专门的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用吸取顶部蓄水池的水。先用水充满管子并夹住其一端，以防止管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子，水开始流出，取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科 进水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度20cm)，用虹吸管采取池子深处的粘泥。采集位于该系统内滤器的水，沉淀物，碎砾等。 注意：所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理位置。如
12、果蓄水池和水塔之间的管道短，那么只需采集一份标本。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科标本的运输和相关生物安全要求u在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3)贮藏在实验室或其他地方。u对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20冻存备用。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌操作生物安全性u应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。u生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。u操作人员培训。u菌种保存。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒 ）种或样本运输管理规定病原菌名
13、称危害程度 分类实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类学名中文名大量活菌 操作动物感 染实验样本 检测非感染性 材料实验A/BUN 编 号Legionella pneumophila嗜肺军团 菌第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373武汉市疾病预防控制中心微生物检验科Part III：军团菌的分离与检测武汉市疾病预防控制中心微生物检验科水样标本中军团菌的分离方法检测依据: 公共场所集中空调通风系统卫生 规范中的集中空调通风系统 冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌 的检验方法见附录B。 适用于各种环境标本军团菌检 测 ，包括： 饮用水、工业用 水、天然水以及一些如沉积 物、沉
14、淀物、软泥等物质。武汉市疾病预防控制中心微生物检验科标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸 水、胸腔引流物水样血清水样处理与制备血清学检测方法： *间接荧光抗体染色法 *试管凝集试验 *ELISA法 接种军团菌BCYE培养基接种军团菌选择性 GVPC培养基37，5%CO2，培养3-14天挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检37,5%CO2, 培养3-14天革兰氏染色阴 性杆菌革兰氏染色阳 性杆菌纯培养 弃去确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测生化试验 尿液抗原 检测武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌水质检测概括1. 采样2. 浓缩3. 培养4. 分离5. 鉴定武汉市疾病预防控制中心微生物检验科
15、实验所需仪器设备90mm平皿3537孵箱滤器（大的不锈钢制成的滤器）正压膜蠕动过滤泵：流速可调。3升/分钟注意：样本量少，也可用真空辅助的滤过系统代替膜滤器：0.22um或0.45um水浴锅：离心机：涡旋振荡器：显微镜：武汉市疾病预防控制中心微生物检验科军团菌检测所需准备基本试 剂1.培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)2.试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液）3.酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（ 0.03mol/L KOH）4.血清学试剂武汉市疾病预防控制中心微生物检验科培养检测所需准备材料1.直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿2.培养箱，CO2能够恒温保持在（361）。3.水浴箱，能够保持在（501）4.显微镜或荧
