[医学保健]质粒DNA的分离、纯化

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1、n质粒是染色体外的DNA分子,大小可为1kb到 200kb。n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环 状的分子,以超螺旋形式存在。它是细菌内 的共生型遗传因子。n其复制和遗传独立于细菌染色体,但复制和 转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。一、实验原理质粒质粒DNADNA的分离、纯化的分离、纯化质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法q 煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状 分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子; 当加热处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象; 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成 沉淀,而复

2、性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液 相中,从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法q 碱裂解法原理 当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价 闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象; SDS是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使 一些蛋白质变性,所以SDS处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁 的破裂,从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放 出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境,就会变性。 然后,用酸性乙酸钾来中和溶液,使溶液处于中性,质粒DNA将 迅速复性,而基因组DNA,由于分子巨大,难以复性。离心后,

3、质 粒DNA将在上清中,而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到 离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取 出来。q 碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液菌种 :E. coli MV1184(含pUC118)、 E. coli K12(含pEGFP) 设备 :eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l), 台式高 速离心机, 涡旋振荡器 试剂:LB液体培养基 、溶液、溶液、溶液 、RNA酶A 、饱 和酚:氯仿 1:1 二、材料、设备及试剂 溶液:50mM 葡萄糖;25mM TrisHC

4、l(pH8.0);10mM EDTA溶液:(新鲜配制)0.2N NaOH;1 SDS溶液:5M KAC 10ml;冰醋酸 11.5ml;水 28.5ml1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟 。 4、加入新配制的溶液200l, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次 ,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉 淀混匀,冰浴中5-10分钟

5、,4下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀 ,4下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后 置于-20冰箱中20分钟,然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇 洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温 干燥。 10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0,含20g /ml RNaseA)中,储于- 20冰箱中。

6、三、操作步骤 实验结果:获得质粒DNA(pUC118及pEGFP) 四、注意事项四、注意事项材料准备材料准备 使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌 体导致开环质粒增加) 培养时应加入筛选压力,否则菌体易 污染,质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝 或大质粒,则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接(质粒丢失)四、注意事项四、注意事项细胞裂解细胞裂解 菌体量适当。 培养基去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长(5分钟),否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长,否则会有基因组DNA的污染。 G菌、酵母质粒的提取,应先用酶法或机械法处理,以 破壁。四、注意事项四、注意事项核酸分

7、离、纯化核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应 提供相应的缓冲体系 采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但 动作要轻柔 离心分离两相时,应保证一定的转速和时 间 针对不同材料的特点,在提取过程中辅以 相应的去杂质的方法四、注意事项四、注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀,沉淀 会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),有利于充 分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤,以除去盐离子等 晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥) 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNas

8、e pH值为8.0,可防止DNA发生酸解 1.菌体老化2.碱裂解不充分3.菌体中无质粒4.溶液使用不当1.请涂布平板培养后,重新挑选 新菌落进行液体培养2.可减少菌体用量或增加溶液 的用量3.不要频繁转接,每次接种时应 接种单菌落。检查抗生素使 用浓度是否正确。4.溶液在温度较低时可能出 现浑浊,置于37保温片刻直 至溶解为清亮的溶液。五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题一:未提出质粒或质粒得率较低,如何解决? 原 因对 策1.混有蛋白2.混有RNA3.混有基因组DNA1.不要使用过多菌体。重新纯化 DNA,去除蛋白、多糖、多酚等 杂质2.加入RNaseA室温放置一段时间

9、3.加入溶液II 和III后防止剧烈振荡 ,可能把基因组DNA剪切成碎片 从而混杂在质粒中。细菌培养 时间过长会导致细胞和DNA的 降解,培养时间不要超过16小时 。五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题二:质粒纯度不高,如何解决? 原 因对 策1. 简要叙述溶液、溶液和溶液的作用,以及实验中 分 别加入上述溶液后,反应体系出现的现象及其成因。2. 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么?六、问题与讨论六、问题与讨论现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学”或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，

10、形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、华中科技大学、郑州大学等学校。 中医即中国传统医药学，是形成于数千年前的中国，是建立在人们与疾病长期斗争的经验总结及阴阳五行、八纲脏腑辨证基础上，运用朴素辩证法及思辨推理方法，认识机体、自然、疾病三者关系，发展起来的一门以“功能人”包括功能脏器为概念的独特的医学哲学理论体系。在治疗上，除了药物外，还有针灸、推拿气功、耳针等特殊疗法，它是世界传统医学中最完善的一种医学理论体系。它为人类尤其为中国人民健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 西医学是最近三四百 年来建立在解剖学、生

11、物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响各自发展。事实也证明这一切，中医长期停滞不前、疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制

12、约，在小小SARS、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助 中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车，风马牛不相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 至于循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 总之，目前以中西医学为主的世界各种医学科学都存在不完

13、整性的瑕疵，即都是以不完整的人为研究对象的医学科学，故不能解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学史上一切疑难模糊问题，成为阻碍医学科学前进的羁绊。的确，要解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学上一切疑难模糊问题，显然已完全超出了中西医学所涉 及的范畴，我们必须跳出中西医学的理论框架，建立起一个新的医学理论体系 - 东方医学和西方医学（即西医）的融合形成现代系统医学。该体系所涉及的一切问题不管从广度上，还是从深度上，都应该远远超过现有的中西医学理论，并将现有中西医学理论纳入自己的理论框架范围之内。为了肩负起这一历史使命，原创人生、医学理论体系灵魂医学 soul medicine 应运而生，她不但

14、从宏观上或战略上圆满解释并解决了存在于人类医学及人文社会科学史上的一切疑难模糊问题，而且还能够使人们得以启迪人生，不得不重新认识人类自身、不得不重新认识人类赖以生存的这个多维世界。医学化验 医学定义（medicine），是处理人健康定义中人的生理处于良好状态相关问题的一种科学，以治疗预防生理疾病和提高人体生理机体健康为目的。狭义的医学只是疾病的治疗和机体有效功能的极限恢复，广义的医学还包括中国养生学和由此衍生的西方的营养学。现在世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。医学的科学性在与应用基础医学的理论不断完善和实践的验证，例如生化、生理、微生物学、解剖、病理学、药理学、统计

15、学、流行病学，中医学及中医技能等，来治疗疾病与促进健康。虽然东西方由于思维方式的不同导致研究人体健康与外界联系及病理机制的宏观微观顺序不同，但在不远的将来中西医实践的丰富经验的积累和理论的形成必将诞生新的医学- 人类医学。 不同于现代医学，不同于传统中医， 金水医学诞生了，金水医学是以驱除病理，恢复生理为主张的全新医学 ，走出了人类医学的误区，治疗疾病的特色鲜明，不论是任何疾病都能做到从危为安，由重到轻的恢复办法。金水医学认识到人体是生命体，生命体有自己的强大的生理自我愈合功能，帮助生命体恢复自主作用才是治疗疾病的根本。针对当今现代文明病，现代疑难病，现代慢性病，亚健康，一体多病，取得了巨大的

16、成功，治疗法则为“胃肠洁，气血流，玄府开，营卫昌”人生命体运动符合自然节律，最终达到人体生理增强，消灭疾病的目的。 编辑本段医学的分类医学研究 医学可分为现代医学（即通常说的西医学）和传统医学（包括中医学、藏医学、蒙医学等）多种医学体系。不同地区和民族都有相应的一些医学体系，宗旨和目的不相同。印度传统医学系统也被认为很发达。 研究领域大方向包括基础医学、临床医学、检验医学、预防医学、保健医学、康复医学等。 基础医学包括：医学生物数学, 医学生物化学, 医学生物物理学 ,人体解剖学, 医学细胞生物学 ,人体生理学, 人体组织学 ,人体胚胎学, 医学遗传学, 人体免疫学, 医学寄生虫学, 医学微生物学 ,医学病毒学, 人体病理学 ,病理生理学, 药理学, 医学实验动物学, 医学心理学, 生物医学工程学 ,医学信息学, 急救学, 护病学, 新中心法则。