《高效液相色谱基础》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱基础（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高效液相色谱仪基础福立分析仪器有限公司液相色谱基础常见的分离方式化学物质成分的定性和定量分析离不开分离，我们常见 的分离方式有以下几种：蒸馏、离心、电泳、过滤、色谱等 ，其中色谱分离是最重要和有效的手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的 各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发 生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流 出。又称为色层法、层析法。液相色谱基础本世纪初，俄国科学家茨维特（M.S.Tswett）提出经典液相色谱法后，色谱分析法取得了迅速的发展， 3040年代
2、发展了柱分配色谱、纸色谱，50年代发展了气相色谱法、薄层色谱法，60年代发展了凝胶色谱法、高效液相色谱法70年代发展了高效毛细柱气相色谱法，80年代发展了毛细管电泳、电色谱，90年代出现了光色谱。液相色谱基础茨维特实验的原形1906年茨维特用右边图示的实验装置使用液体淋洗的办法实现了多种物质的分离从而确立 了色谱分析法。从此这个实验方法就成为：经典液相色谱法时至今日这种方法还被广泛地应用着。随着科学技术的发展，科学工作者改进了液相色谱柱的填料，从而就出现了高效液相色谱 分析。几种英文缩写的解释： HPLCHigh Performance Liquid Chromatograghy HPLCHi
3、gh Pressure Luquid Chromatograghy HSLCHigh Speed Liquid Chromatograghy HRLCHigh Resolution Liquid Chromatograghy液相色谱基础HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压-压力可达1530Mpa。高速-流速为0.110.0 ml/min。高效-可达每米5000塔板以上。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内 即可完成。分
4、辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组 分或做制备。 液相色谱基础高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法 经典液相色谱法 柱 长： 1025cm 10200cm口 径： 210mm 1050mm粒 度： 550um（2500目300目） 75600um（200目30目）柱 压 力： 220MPa 0.0010.1MPa柱 效： 2103 5104 /m 250/m进 样 量： 10-610-2g
5、 110g分析时间： 3分钟1小时 120小时液相色谱基础基本概念和术语 1色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时 间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出 一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测 器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、 流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱
6、下来也 会产生漂移。 色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线 上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线） 不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。 前者少见。液相色谱基础基本概念和术语 色谱图液相色谱基础拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称 因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典 规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。
7、 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间 的距离。W4 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。 Wh/22.355 标准偏差（standard deviation，)-正态分布曲线x1时（拐点）的 峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分 在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形 瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。基本概念和术语液相色
8、谱基础基本概念和术语2定性参数（保留值） 死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂） 通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死体积(dead volume，V0)-由进样器进样口到检测器流动池未被固定 相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定 相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池 体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为 防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0Ft0（F为流速） 保留时间(retention time，tR)-从进样开始到某个组分在柱后出现 浓度极大
9、值的时间。 保留体积(retention volume，VR)-从进样开始到某组分在柱后出现 浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRFtR液相色谱基础3柱效参数 理论塔板数(theoretical plate number，N)-用于定量表示色谱柱的 分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布 等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质 。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的 峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更 为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。 N与 柱长成正
10、比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明， 则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用 调整保留时间(tR)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。 理论塔板高度(theoretical plate height，H)-每单位柱长的方差。 实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。基本概念和术语液相色谱基础基本概念和术语4相平衡参数 分配系数(distribution coefficient，K)-在一定温度下，化合物在两相间 达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有
11、关。 在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换 色谱法为选择性系数(或称交换系数)， 凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可 用分配系数来表示。在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于 组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得 到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为 拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只 有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱 柱；
12、K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相 差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动 相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分 离的目的。液相色谱基础基本概念和术语容量因子(capacity factor，k)-化合物在两相间达到分配平衡时， 在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（tR）是 不保留组分保留时间（t0）的几倍。k0时， 化合物全部存在于流动相 中，
13、在固定相中不保留，tR0；k越大，说明固定相对此组分的容量越 大，出柱慢，保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性 质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、 Vm有关。由于tR、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用 更广泛。 选择性因子(selectivity factor，)-相邻两组分的分配系数或容量 因子之比。又称为相对保留时间（美国药典）。要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中 的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说 ，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性
14、质的差异，即分子间 相互作用力的差异。液相色谱基础基本概念和术语 5分离参数 分离度(resolution，R)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。 也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当W1W2时，R1。当R1时， 称为4分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。 R1.5时，称为6分离，裸露峰面积为99.7%。R1.5称为完全分离。中国药典规定R应大于1.5。提高分离度有三种途径： 增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。 更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。 增加选择性。当1时，R0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。 一般可以采取以下
15、措施来改变选择性： a. 改变流动相的组成及pH值； b. 改变柱温； c. 改变固定相。 改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动 相的组成来实现。k趋于0时，R也趋于0；k增大，R也增大。但k不能太大， 否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一 般k在110范围内，最好为25，窄径柱可更小些。液相色谱的分类液相色谱的常用分离方法键合相色谱法何为键合相色谱法：将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，而生成化学键合相，并进而发展成键合相色谱法。键合相色谱法的起因：化学键合相色谱法是由液液分配色谱法发展起来的，分配色谱法虽然由较好的分离效果，但是在实际使用时，由于机械涂覆在载体表面的固定液的流失，使分离 能力及分离选择性降低，而且流失的固定液也会给检测器带来噪声，也不适合
