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1、植物病理学专业毕业论文植物病理学专业毕业论文 精品论文精品论文 白僵菌硝酸盐还原酶缺陷白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体的筛选与鉴定型突变体的筛选与鉴定关键词：白僵菌关键词：白僵菌 硝酸还原酶硝酸还原酶 突变体突变体 筛选标记筛选标记摘要：白僵菌是一种重要的虫生生防真菌，在害虫防治中有着广泛的应用，目 前其菌种改良的首选方法是基因工程育种，而筛选安全标记对获得工程菌的释 放和推广有着重要意义。构建白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体，以此为转化 受体，通过硝酸盐为唯一氮源筛选转化子，可以避免引入任何外源筛选标记， 使转基因生物更安全。 本研究采用两种诱变方法获得白僵菌不利用硝酸盐突 变体，分别为甲基磺酸
2、乙酯(EMS)诱变原生质体和氯酸盐培养基(WAC)诱变菌丝。 EMS 诱变原生质体方法中对 EMS 处理浓度和处理时间进行了优化，其最佳条件 为 20l EMS 处理时间为 1h 至 2h；诱变原生质体通过富集培养后获得突变体 149 株；149 株突变体经过氮源筛选获得不利用硝酸盐突变体 88 株。88 株突变 体在硝酸盐培养基上连续培养 7 代后得到稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌株 为 68 株，稳定率为 6687之间，属于 nitl； nitl 突变体生理表现型为 不利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；稳定的突变体硝酸盐还原酶活性与 野生型相比显著降低，最低为 139.13g/g.
3、h，是野生型菌株硝酸盐还原酶酶 活性的三分之一。同时，EMS 诱变获得的 88 个突变体中，在 10l EMS 处理 2h 原生质体得到 4 株突变体除不利用硝酸盐外，完全不利用亚硝酸盐，利用次黄 嘌呤，与前人报道突变体生理表现不一致，为新发现表型，暂命名为 nitX。 WAC 方法诱变获得 35 株突变体，通过 MM 培养基培养筛选到 21 株不利用硝酸盐 突变体，其生理表现型为不利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；21 株突变 体在硝酸盐培养基上连续培养 7 代后共获得稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌 株 19 株，稳定率达 90.47；稳定突变体硝酸盐还原酶活性为 154.47g/g
4、.h，比野生型菌株降低了 226.61g/g.h。 通过 PCR、测序、 BLAST 及 DNAMEN 对硝酸还原酶活性最低的稳定突变体菌株(编号 20-2-17)进行 硝酸还原酶基因序列分析。PCR 结果表明野生型和编号 20-2-17 突变体菌株均 扩增出硝酸还原酶基因为 0.5kb、2.8kb 和 3.5kb 片段，选择 2.8kb 片段测序、 BLAST 分析表明编号 20-2-17 突变体硝酸还原酶基因与虫草白僵菌的硝酸还原 酶基因同源性为 99，具有相同的 4 个保守结构域；与野生型硝酸还原酶氨基 酸比对表明：位于保守域中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结构域中 695 处 T(苏氨
5、酸)突变为 K(赖氨酸)，位于保守域中次黄嘌呤(NAD)核苷酸结构域中 787 处 S(丝氨酸)变突变为 C(胱氨酸)，789 处 A(丙氨酸)变突变为 V(缬氨酸)。保守区 域蛋白的置换至使硝酸还原酶蛋白组成失活导致其他电子传递链受到影响，确 切原因是次黄嘌呤脱氧化酶(NAD)和黄素腺嘌呤脱氧化酶(FAD)活性失活，进步 控制黄素腺嘌呤二核苷酸脱氧化酶(FADH2)和甲基紫酯还原酶活性，造成菌株不 能利用硝酸盐。结合突变体生理表现与基因序列分析，进一步说明编号 20-2- 17 突变体为不利用硝酸突变体。 本实验初步建立了球孢白僵菌 NR 缺陷突变 体菌株的诱变、筛选和鉴定方法，为获得更详细
6、的突变体信息，还需要对突变 体进行进一步的筛选鉴定，为最终利用 NR 基因建立球孢白僵菌专用筛选标记奠 定基础。正文内容正文内容白僵菌是一种重要的虫生生防真菌，在害虫防治中有着广泛的应用，目前 其菌种改良的首选方法是基因工程育种，而筛选安全标记对获得工程菌的释放 和推广有着重要意义。构建白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体，以此为转化受 体，通过硝酸盐为唯一氮源筛选转化子，可以避免引入任何外源筛选标记，使 转基因生物更安全。 本研究采用两种诱变方法获得白僵菌不利用硝酸盐突变 体，分别为甲基磺酸乙酯(EMS)诱变原生质体和氯酸盐培养基(WAC)诱变菌丝。 EMS 诱变原生质体方法中对 EMS 处理浓度
7、和处理时间进行了优化，其最佳条件 为 20l EMS 处理时间为 1h 至 2h；诱变原生质体通过富集培养后获得突变体 149 株；149 株突变体经过氮源筛选获得不利用硝酸盐突变体 88 株。88 株突变 体在硝酸盐培养基上连续培养 7 代后得到稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌株 为 68 株，稳定率为 6687之间，属于 nitl； nitl 突变体生理表现型为 不利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；稳定的突变体硝酸盐还原酶活性与 野生型相比显著降低，最低为 139.13g/g.h，是野生型菌株硝酸盐还原酶酶 活性的三分之一。同时，EMS 诱变获得的 88 个突变体中，在 10l EM
8、S 处理 2h 原生质体得到 4 株突变体除不利用硝酸盐外，完全不利用亚硝酸盐，利用次黄 嘌呤，与前人报道突变体生理表现不一致，为新发现表型，暂命名为 nitX。 WAC 方法诱变获得 35 株突变体，通过 MM 培养基培养筛选到 21 株不利用硝酸盐 突变体，其生理表现型为不利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；21 株突变 体在硝酸盐培养基上连续培养 7 代后共获得稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌 株 19 株，稳定率达 90.47；稳定突变体硝酸盐还原酶活性为 154.47g/g.h，比野生型菌株降低了 226.61g/g.h。 通过 PCR、测序、 BLAST 及 DNAMEN 对硝
9、酸还原酶活性最低的稳定突变体菌株(编号 20-2-17)进行 硝酸还原酶基因序列分析。PCR 结果表明野生型和编号 20-2-17 突变体菌株均 扩增出硝酸还原酶基因为 0.5kb、2.8kb 和 3.5kb 片段，选择 2.8kb 片段测序、 BLAST 分析表明编号 20-2-17 突变体硝酸还原酶基因与虫草白僵菌的硝酸还原 酶基因同源性为 99，具有相同的 4 个保守结构域；与野生型硝酸还原酶氨基 酸比对表明：位于保守域中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结构域中 695 处 T(苏氨 酸)突变为 K(赖氨酸)，位于保守域中次黄嘌呤(NAD)核苷酸结构域中 787 处 S(丝氨酸)变突变为 C
10、(胱氨酸)，789 处 A(丙氨酸)变突变为 V(缬氨酸)。保守区 域蛋白的置换至使硝酸还原酶蛋白组成失活导致其他电子传递链受到影响，确 切原因是次黄嘌呤脱氧化酶(NAD)和黄素腺嘌呤脱氧化酶(FAD)活性失活，进步 控制黄素腺嘌呤二核苷酸脱氧化酶(FADH2)和甲基紫酯还原酶活性，造成菌株不 能利用硝酸盐。结合突变体生理表现与基因序列分析，进一步说明编号 20-2- 17 突变体为不利用硝酸突变体。 本实验初步建立了球孢白僵菌 NR 缺陷突变 体菌株的诱变、筛选和鉴定方法，为获得更详细的突变体信息，还需要对突变 体进行进一步的筛选鉴定，为最终利用 NR 基因建立球孢白僵菌专用筛选标记奠 定基
11、础。 白僵菌是一种重要的虫生生防真菌，在害虫防治中有着广泛的应用，目前其菌 种改良的首选方法是基因工程育种，而筛选安全标记对获得工程菌的释放和推 广有着重要意义。构建白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体，以此为转化受体， 通过硝酸盐为唯一氮源筛选转化子，可以避免引入任何外源筛选标记，使转基 因生物更安全。 本研究采用两种诱变方法获得白僵菌不利用硝酸盐突变体，分别为甲基磺酸乙酯(EMS)诱变原生质体和氯酸盐培养基(WAC)诱变菌丝。EMS 诱变原生质体方法中对 EMS 处理浓度和处理时间进行了优化，其最佳条件为 20l EMS 处理时间为 1h 至 2h；诱变原生质体通过富集培养后获得突变体 149
12、株；149 株突变体经过氮源筛选获得不利用硝酸盐突变体 88 株。88 株突变体在 硝酸盐培养基上连续培养 7 代后得到稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌株为 68 株，稳定率为 6687之间，属于 nitl； nitl 突变体生理表现型为不利用 硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；稳定的突变体硝酸盐还原酶活性与野生型 相比显著降低，最低为 139.13g/g.h，是野生型菌株硝酸盐还原酶酶活性的 三分之一。同时，EMS 诱变获得的 88 个突变体中，在 10l EMS 处理 2h 原生 质体得到 4 株突变体除不利用硝酸盐外，完全不利用亚硝酸盐，利用次黄嘌呤， 与前人报道突变体生理表现不一致，
13、为新发现表型，暂命名为 nitX。 WAC 方法诱变获得 35 株突变体，通过 MM 培养基培养筛选到 21 株不利用硝酸盐突变 体，其生理表现型为不利用硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；21 株突变体在 硝酸盐培养基上连续培养 7 代后共获得稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌株 19 株，稳定率达 90.47；稳定突变体硝酸盐还原酶活性为 154.47g/g.h，比野 生型菌株降低了 226.61g/g.h。 通过 PCR、测序、BLAST 及 DNAMEN 对硝酸 还原酶活性最低的稳定突变体菌株(编号 20-2-17)进行硝酸还原酶基因序列分 析。PCR 结果表明野生型和编号 20-2-1
14、7 突变体菌株均扩增出硝酸还原酶基因 为 0.5kb、2.8kb 和 3.5kb 片段，选择 2.8kb 片段测序、BLAST 分析表明编号 20-2-17 突变体硝酸还原酶基因与虫草白僵菌的硝酸还原酶基因同源性为 99，具有相同的 4 个保守结构域；与野生型硝酸还原酶氨基酸比对表明：位 于保守域中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结构域中 695 处 T(苏氨酸)突变为 K(赖氨 酸)，位于保守域中次黄嘌呤(NAD)核苷酸结构域中 787 处 S(丝氨酸)变突变为 C(胱氨酸)，789 处 A(丙氨酸)变突变为 V(缬氨酸)。保守区域蛋白的置换至使 硝酸还原酶蛋白组成失活导致其他电子传递链受到影响
15、，确切原因是次黄嘌呤 脱氧化酶(NAD)和黄素腺嘌呤脱氧化酶(FAD)活性失活，进步控制黄素腺嘌呤二 核苷酸脱氧化酶(FADH2)和甲基紫酯还原酶活性，造成菌株不能利用硝酸盐。结 合突变体生理表现与基因序列分析，进一步说明编号 20-2-17 突变体为不利用 硝酸突变体。 本实验初步建立了球孢白僵菌 NR 缺陷突变体菌株的诱变、筛 选和鉴定方法，为获得更详细的突变体信息，还需要对突变体进行进一步的筛 选鉴定，为最终利用 NR 基因建立球孢白僵菌专用筛选标记奠定基础。 白僵菌是一种重要的虫生生防真菌，在害虫防治中有着广泛的应用，目前其菌 种改良的首选方法是基因工程育种，而筛选安全标记对获得工程菌
16、的释放和推 广有着重要意义。构建白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体，以此为转化受体， 通过硝酸盐为唯一氮源筛选转化子，可以避免引入任何外源筛选标记，使转基 因生物更安全。 本研究采用两种诱变方法获得白僵菌不利用硝酸盐突变体， 分别为甲基磺酸乙酯(EMS)诱变原生质体和氯酸盐培养基(WAC)诱变菌丝。EMS 诱变原生质体方法中对 EMS 处理浓度和处理时间进行了优化，其最佳条件为 20l EMS 处理时间为 1h 至 2h；诱变原生质体通过富集培养后获得突变体 149 株；149 株突变体经过氮源筛选获得不利用硝酸盐突变体 88 株。88 株突变体在 硝酸盐培养基上连续培养 7 代后得到稳定不利用硝酸盐突变体(nitl)菌株为 68 株，稳定率为 6687之间，属于 nitl； nitl 突变体生理表现型为不利用 硝酸盐，利用亚硝酸盐和次黄嘌呤；稳定的突变体硝酸盐还原酶活性与野生型 相比显著降低，最低为 139.13g/g.h，是野
