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1、生物化工专业优秀论文生物化工专业优秀论文 曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究关键词：植酸酶基因关键词：植酸酶基因 克隆表达克隆表达 饲料添加剂饲料添加剂 曲霉植酸酶基因曲霉植酸酶基因摘要：植酸酶作为一种单胃动物饲料添加剂，其饲喂效果已经在世界范围内得 到确认。但目前植酸酶在饲料中的推广应用还相当有限，究其原因主要有二： 一是天然材料中植酸酶含量太低导致植酸酶生产成本过高；二是当前商业植酸 酶的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。通过从自然界筛选具备良好饲用 酶潜质的植酸酶产生菌，利用分子生物学技术获得植酸酶基因，再将基因高效 表达在生物反应器中是解决上述问题的一个
2、策略，业已成为植酸酶的世界性研 究热点之一。 本研究从土壤中筛选出一株黑曲霉(Aspergillus niger)植酸 酶产生菌和一株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶产生菌，克隆了二者的 植酸酶基因，并将其高效表达在毕赤酵母中，获得了性质优良的基因工程植酸 酶。另外，本研究将烟曲霉植酸酶成功表达在烟草中，首次利用植物生物反应 器生产这类耐热植酸酶，为其今后的生产开辟了一条新途径，同时，鉴于植物 基因工程在解决作物有效利用土壤有机磷资源上所具备的潜能，对转基因烟草 在磷胁迫条件下的生长状况也进行了分析。具体实验内容及结果如下： 1.利 用植酸钙平板初筛和摇瓶复筛的方法，
3、在 30和 45分别获得植酸酶产生菌 WY-6 和 WY-2，酶活力均达到 0.14U/mL。菌株 WY-6 所产植酸酶的最适 pH 为 3.0，最适温度为 55；菌株 WY-2 所产植酸酶的最适 pH 为 5.5，最适温度亦为 55。二者分别被鉴定为黑曲霉菌和烟曲霉菌，在中国工业微生物菌种保藏中 心的菌种收录号为 CICC 40700 和 CICC 40699。 2.通过 PCR 扩增的方法获得 来源于黑曲霉 WY-6 和烟曲霉 WY-2 的植酸酶基因全序列，分别命名为 phyA(GenBank accessionno.AY745739)和 fphyA(GenBank accessionno
4、.AY745738)。phyA 全长 1506bp，共编码 467 个氨基酸；fphyA 全 长 1459bp，共编码 465 个氨基酸。由 phyA 所推导的氨基酸序列与黑曲霉 NRRL3135 植酸酶具有 97的同源性；由 fphyA 所推导的氨基酸序列与烟曲霉 ATCC34625 植酸酶具有 91的同源性，与黑曲霉 NRRL3135 植酸酶具有 66的 同源性。 3.将 phyA 克隆到表达载体 pPIC9K 中，电击转入毕赤酵母 GS115， 获得黑曲霉 WY-6 植酸酶基因工程酵母 GS115/phyA。经甲醇诱导 60h 后， GS115/phyA 的产酶达到最高峰，酶活力达到 2
5、8.2U/mL，为出发菌株酶活力的 200 倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离子交换层析三个分离步骤后，重 组植酸酶得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为 147U/mg，分子量约为 67kDa；在 pH2.56.5 范围内均具有较高酶活性，两个最适 pH 分别为 3.0 和 5.5；最适温 度为 55；以植酸钠为底物时的 Km 为 0.112mmol/L，klt;,catgt; 为 243/s；与胃蛋白酶以 0.01 的比率(pepsin/phytase，wt/wt)混合作用 2h 后， 仍保留 70.9的残余酶活力。 4.将 fphyA 克隆到表达载体 pPIC9K 中，电击 转入毕赤酵母 G
6、S115，获得烟曲霉 WY-2 植酸酶基因工程酵母 GS115/fphyA。经 甲醇诱导 60h 后，GS115/fphyA 的产酶达到最高峰，酶活力达到 16U/mL，为出 发菌株酶活力的 114 倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离子交换层析及凝 胶过滤层析四个分离步骤后，重组植酸酶得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为 51U/mg，分子量约为 88kDa；仅在酸性范围内呈现酶活性，最适 pH 为 5.5；最 适温度为 55；具有较高耐热能力，90处理 15min 后，保留 43.8的残余酶 活力；可水解多种磷酸底物，其中对植酸钠的特异性最高，以植酸钠为底物时的 Klt;,mgt;为 0.11
7、4mmol/L，Klt;,catgt;为 102/s； 与胃蛋白酶以 0.1 的比率(pepsin/phytase，wt/wt)混合作用 2h 后，仍具有 90.1的残余酶活力；蛋白二级结构受溶液 pH 值影响，在 pH6：0 时的 -螺 旋含量最高(35.6)。 5.将含烟草钙调蛋白信号肽序列的烟曲霉 WY-2 植酸 酶基因组成型表达在烟草中。PCR 鉴定和 Southern 杂交分析表明植酸酶基因已 整合到烟草的基因组 DNA 中；RT-PCR 和 Western 杂交结果说明植酸酶基因已成 功转录并在蛋白水平上得到表达。转基因烟草经土培 4 周后达到了最高的植酸 酶表达水平，其叶片中的植
8、酸酶含量达到总可溶蛋白的 2.3，酶活力为野生 型烟草的 13 倍。重组植酸酶的分子量约为 63kDa；最适 pH 为 5.5；最适温度为 55：具有较高耐热能力，90处理 15min 后，仍保持 28.7的残余酶活力。 6.在烟草钙调蛋白信号肽的引导下，重组植酸酶由转基因烟草的根分泌到体外。 水培 40 天后，转基因烟草培养基中的植酸酶含量达到烟草根分泌蛋白的 2.012，酶活力为野生型烟草的 15.3 倍。以植酸盐为唯一磷源的培养条件下， 转基因烟草的生长状况明显好于野生型烟草，生长 45 天的转基因烟草的地上部 干重、根干重、总磷含量分别为对照烟草的 2.0、1.5、2.7 倍。进一步分
9、析培 养基中植酸盐的消耗情况表明磷营养的提高与植酸酶基因的表达有关。正文内容正文内容植酸酶作为一种单胃动物饲料添加剂，其饲喂效果已经在世界范围内得到 确认。但目前植酸酶在饲料中的推广应用还相当有限，究其原因主要有二：一 是天然材料中植酸酶含量太低导致植酸酶生产成本过高；二是当前商业植酸酶 的热稳定性难以完全满足饲料加工的要求。通过从自然界筛选具备良好饲用酶 潜质的植酸酶产生菌，利用分子生物学技术获得植酸酶基因，再将基因高效表 达在生物反应器中是解决上述问题的一个策略，业已成为植酸酶的世界性研究 热点之一。 本研究从土壤中筛选出一株黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶 产生菌和一株
10、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶产生菌，克隆了二者的植 酸酶基因，并将其高效表达在毕赤酵母中，获得了性质优良的基因工程植酸酶。 另外，本研究将烟曲霉植酸酶成功表达在烟草中，首次利用植物生物反应器生 产这类耐热植酸酶，为其今后的生产开辟了一条新途径，同时，鉴于植物基因 工程在解决作物有效利用土壤有机磷资源上所具备的潜能，对转基因烟草在磷 胁迫条件下的生长状况也进行了分析。具体实验内容及结果如下： 1.利用植 酸钙平板初筛和摇瓶复筛的方法，在 30和 45分别获得植酸酶产生菌 WY-6 和 WY-2，酶活力均达到 0.14U/mL。菌株 WY-6 所产植酸酶的最适 pH
11、为 3.0，最 适温度为 55；菌株 WY-2 所产植酸酶的最适 pH 为 5.5，最适温度亦为 55。 二者分别被鉴定为黑曲霉菌和烟曲霉菌，在中国工业微生物菌种保藏中心的菌 种收录号为 CICC 40700 和 CICC 40699。 2.通过 PCR 扩增的方法获得来源于 黑曲霉 WY-6 和烟曲霉 WY-2 的植酸酶基因全序列，分别命名为 phyA(GenBank accessionno.AY745739)和 fphyA(GenBank accessionno.AY745738)。phyA 全长 1506bp，共编码 467 个氨基酸；fphyA 全长 1459bp，共编码 465 个氨
12、基酸。由 phyA 所推导的氨基酸序列与黑曲霉 NRRL3135 植酸酶具有 97的同源性；由 fphyA 所推导的氨基酸序列与烟曲霉 ATCC34625 植酸酶具有 91的同源性，与 黑曲霉 NRRL3135 植酸酶具有 66的同源性。 3.将 phyA 克隆到表达载体 pPIC9K 中，电击转入毕赤酵母 GS115，获得黑曲霉 WY-6 植酸酶基因工程酵母 GS115/phyA。经甲醇诱导 60h 后，GS115/phyA 的产酶达到最高峰，酶活力达到 28.2U/mL，为出发菌株酶活力的 200 倍。经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤、阴离 子交换层析三个分离步骤后，重组植酸酶得以纯化。纯化后的
13、植酸酶比活力为 147U/mg，分子量约为 67kDa；在 pH2.56.5 范围内均具有较高酶活性，两个 最适 pH 分别为 3.0 和 5.5；最适温度为 55；以植酸钠为底物时的 Km 为 0.112mmol/L，klt;,catgt;为 243/s；与胃蛋白酶以 0.01 的比率 (pepsin/phytase，wt/wt)混合作用 2h 后，仍保留 70.9的残余酶活力。 4.将 fphyA 克隆到表达载体 pPIC9K 中，电击转入毕赤酵母 GS115，获得烟曲霉 WY-2 植酸酶基因工程酵母 GS115/fphyA。经甲醇诱导 60h 后，GS115/fphyA 的产酶达 到最高
14、峰，酶活力达到 16U/mL，为出发菌株酶活力的 114 倍。经饱和硫酸铵分 级沉淀、超滤、阴离子交换层析及凝胶过滤层析四个分离步骤后，重组植酸酶 得以纯化。纯化后的植酸酶比活力为 51U/mg，分子量约为 88kDa；仅在酸性范 围内呈现酶活性，最适 pH 为 5.5；最适温度为 55；具有较高耐热能力，90 处理 15min 后，保留 43.8的残余酶活力；可水解多种磷酸底物，其中对植酸 钠的特异性最高，以植酸钠为底物时的 Klt;,mgt;为 0.114mmol/L，Klt;,catgt;为 102/s；与胃蛋白酶以 0.1 的比率 (pepsin/phytase，wt/wt)混合作用
15、2h 后，仍具有 90.1的残余酶活力；蛋白二级结构受溶液 pH 值影响，在 pH6：0 时的 -螺旋含量最高(35.6)。 5. 将含烟草钙调蛋白信号肽序列的烟曲霉 WY-2 植酸酶基因组成型表达在烟草中。 PCR 鉴定和 Southern 杂交分析表明植酸酶基因已整合到烟草的基因组 DNA 中； RT-PCR 和 Western 杂交结果说明植酸酶基因已成功转录并在蛋白水平上得到表 达。转基因烟草经土培 4 周后达到了最高的植酸酶表达水平，其叶片中的植酸 酶含量达到总可溶蛋白的 2.3，酶活力为野生型烟草的 13 倍。重组植酸酶的 分子量约为 63kDa；最适 pH 为 5.5；最适温度为
16、 55：具有较高耐热能力， 90处理 15min 后，仍保持 28.7的残余酶活力。 6.在烟草钙调蛋白信号 肽的引导下，重组植酸酶由转基因烟草的根分泌到体外。水培 40 天后，转基因 烟草培养基中的植酸酶含量达到烟草根分泌蛋白的 2.012，酶活力为野生型 烟草的 15.3 倍。以植酸盐为唯一磷源的培养条件下，转基因烟草的生长状况明 显好于野生型烟草，生长 45 天的转基因烟草的地上部干重、根干重、总磷含量 分别为对照烟草的 2.0、1.5、2.7 倍。进一步分析培养基中植酸盐的消耗情况 表明磷营养的提高与植酸酶基因的表达有关。 植酸酶作为一种单胃动物饲料添加剂，其饲喂效果已经在世界范围内得到确认。 但目前植酸酶在饲料中的推广应用还相当有限，究其原因主要有二：一是天然 材料中植酸酶含量太低导致植酸酶生产成本过高；二是当前商业植酸酶的热稳 定性难以完全满足饲料加工的要求。通过从自然界筛选具备良好饲用酶潜质的 植酸酶产生菌，利用分子
