医学分子生物学实验技术

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1、Date1第一章 蛋白质的分离纯化 生命大分子物质的特点： 1、生命大分子是动物、植物和微生物在进 行新陈代谢时所产生的活性物质 2、生命大分子的特殊性和复杂性 3、生命大分子都是由简单的小分子构成的 物 4、具有特殊的结构和功能 5、生命大分子不稳定Date2材料的选择与处理 材料的选择 有效成分：欲纯化的某种单一的生命大分子 物质。相对于有效成分以外的物质称杂质。材 料 来 源动物植物 根、茎、叶微生物组织、器官血液、分泌物Date3选材原则： 含有效成分丰富、稳定性好； 来源丰富、保持新鲜； 材料适合加工提取； 具有经济利用价值。组织差异性时间差异性生理状态差异性研究对象的选择Date4

2、 蛋白质在组织或细胞中一般都是以 复杂的混合形式存在，每种类型的 细胞都含有上千种不同的蛋白质。 蛋白质的分离(separation， isolation)和纯化(purification)工作 是生物化学中一项艰巨而繁重的任 务。Date5蛋白质纯化的总目标是增加制品的 纯度(purity)或比活(specific activity) ，以增加单位蛋白质重量中所要蛋 白质的含量或生物活性(比活常以活 力单位数毫克蛋白质表示)。 分离纯化某一特定蛋白质的一般程 序可以分为前处理、粗分级分离和 细分级分离3步Date6(1) 前处理 (pretreatment) 分离纯化某一蛋白质，首先要求把

3、蛋白质从原来的组织或细胞中以溶 解的状态释放出来，并保持原来的 天然状态，不丢失生物活性。 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪 组织。Date7种子材料应先去壳甚至去种皮以免 受杂质的污染，油料种子最好先用 低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择适当的 方法，将组织和细胞破碎。Date8机械破碎法捣碎法 研磨法 匀浆法物理破碎法温度差破碎法 压力差破碎法 超声破碎法化学破碎法 利用化学渗透的方法，通过有机 溶剂、抗生素、表面活性剂、金属熬合剂、变 性剂等，使细胞膜破碎的方法。 酶促破碎法 利用酶的活性破坏细胞膜的化学 结构使细胞膜破碎的方法。Date9 如果所要的蛋白质主要集中在

4、某一 细胞组分，如细胞核、染色体、核 糖体或可溶性的细胞质等，则可利 用差速离心方法将它们分开在不同离心力场下沉降的细胞器Date10如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜 质细胞器结合的，则必须利用超声波 或去污剂使膜结构解聚，然后用适当 的介质提取。Date11(2) 粗分级分离 (rough fractionation) 当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获 得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与 其他杂蛋白分离开来。 一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有 机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便 、处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐)，又 能浓缩蛋白质溶液。 有些蛋白质

5、提取液体积较大，又不适于用沉淀或 盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻 真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓 缩。Date12(3) 细分级分离 (fine fractionation) 进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶 过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲 和层析等。必要时还可选择电泳法，包 括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯 化步骤。用于细分级分离的方法一般规 模较小，但分辨率很高。 Date13(4) 结晶 结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋 白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽 管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但 只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才 能形成结

6、晶。 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋 白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断 定制品处于天然状态的有力指标。 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的， 结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态 ，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结 晶过程。 Date14第二节 确立测定方法寻找哪些生物材料中含有有效成分监测有效成分提纯程度光谱法吸收光谱荧光光谱浊度分析电化学法 生物活性检测法 免疫分析法Date15吸收光谱 根据有效成分的颜色、对紫外吸收能力进行 测定； 利用有效成分与生色基团所进行的特殊的呈 色反应进行测定。 荧光法：利用有效成分所进行的特殊的化学 反应并偶联NAD或NADP的还原反应

7、产生 NADH或NADPH。还原型尼克酰胺发荧光。 也可利用NAD和NADP的光谱变化进行测定Date16Date17比色法 葡萄糖O2 H2O 葡萄糖酸H2O2葡萄糖氧化酶H2O2酚4AAP 醌亚胺H2O 浊度法：测定悬浮液在不被吸收的波长下表 观的消光值。 电化学法：测定反应过程中H的浓度变化从 而计算出有效成分含量。 生物活性检测 免疫分析法Date18纯化方案的设计与评价纯化方案：在纯化某一物质过程中，根 据被分离物质的理化性质、分离方法的 优劣，将几种分离方法有机地结合并灵 活应用，实现提取被分离物质的技术路 线，称纯化方案。Date19初分离精细分离盐析法有机溶剂沉淀法电泳法 层析

8、法 离心法离子交换层析 排阻层析 亲和层析纯化方案的设计与评价Date20纯化方案的设计与评价 纯化方案的评价：是对组成纯化方案的 每一种分离方法的评价。有效成分的含量测定比活力测定( )活力单位数 毫克蛋白纯化倍数( )每步的比活力 粗提液比活力收得率( 100 )每步的总活力 粗提液总活力评 价 指 标Date21蛋白质纯度和性质的分析纯度分析性质分析比活性 电泳分析高压液相或气相色谱免疫分析分子质量测定分子结构测定Date22几种常用的蛋白质纯化方法： 根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋 白质的方法： 分子大小； 溶解度； 电荷； 吸附性质； 对配体分子的生物学亲和力等。 Date23根

9、据分子大小不同的纯化方法 1透析和超过滤 透析(dialysis)是利 用蛋白质分子不能 通过半透膜的性质 ，使蛋白质和其他 小分子物质如无机 盐、单糖等分开。 常用的半透膜是玻 璃纸和其他改型的 纤维素材料。Date24 超滤是利用压力 或离心力，强行 使水和其他小分 子溶质通过半透 膜，而蛋白质被 截留在膜上，以 达到浓缩和脱盐 的目的。Date252密度梯度(区带)离心 蛋白质颗粒在具有 密度梯度的介质中 离心时，质量和密 度大的颗粒比质量 和密度小的颗粒沉 降得快，并且每种 蛋白质颗粒沉降到 与自身密度相等的 介质密度梯度时， 即停止不前，最后 各种蛋白质在离心 管中被分离成独立 的区

10、带， Date26密度梯度 常用的密度梯度有蔗糖 梯度，聚蔗糖梯度。 蔗糖便宜，纯度高，浓 溶液(60，WW)密度 可达1.28 gcm3。 聚蔗糖的商品名是Ficoll ，它是由蔗糖和1氯 2，3环氧丙烷合成的 高聚物，Mr约400 000 。 密度梯度在离心管内的 分布是管底的密度最大 ，向上逐渐减小 Date27凝胶过滤层析 (分子排阻 ) （1）凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶颗粒，其内部是 多孔的网状结构， Date28二、利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其 中主要有：溶液的pH，离子强度， 介电常数，温度。 自身因素：在同一的外部条件下，不同 蛋白

11、质具有不同的溶解度，这是因为溶 解度归根结底取决于它们本身的分子结 构，例如分子所带电荷的性质和数量、 亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋 白质分子表面的排列以及由此而产生的 偶极矩等。 Date291. pH控制蛋白质的沉淀 蛋白质处于等电点时，其静电荷为零， 由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力 而趋于聚集沉淀。 不同的蛋白质具有不同的等电点，利用 蛋白质在等电点时溶解度最低的原理， 可以把蛋白质混合物分开。 Date302. 蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白 质的溶解度，这种现象称为盐溶。由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后， 带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白 质分子与

12、水分子间的相互作用却加强， 因而溶解度增高盐溶Date31 盐析：当溶液的离子强度增加到一定数 值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子 强度增加到足够高时，例如饱和或半饱 和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中 沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大 部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。导致 蛋白质表面的疏水基团的暴露盐析（NH4）2SO4）Date323有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙 酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降 低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引 起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。Date333有机溶

13、剂分级分离的机理 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改 变了介质的介电常数。水是高介电常数物质 (20时，80)，有机溶剂是低介电常数物质 (20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此 有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这 样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度 减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子 的聚集和沉淀。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能 与盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使 蛋白质聚集而沉淀。 Date344温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约040之间，大 部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而 增加， 在4050以上，大部分蛋白质变得不 稳

14、定并开始变性，一般在中性pH介质中 即失去溶解能力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此 蛋白质的分级分离操作一般都在0或更 低的温度下进行。 Date35 电泳 是指带电粒子在电场中向 与其自身带相反电荷的电极移动 的现象 正极负极带负电粒子带正电粒子蛋白质的电泳分离Date36+-+-蛋白质胶体颗粒的沉淀 带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）Date37带电颗粒在电场中所受到的电场力F=EQ根据Stoke定律，球形分子在液体中 泳动所受到

15、的阻力 F=6rv电泳原理：Date38F=F 即：EQ= 6rv 时，V=EQ6r当物质在电场中移动时，受到电场 力和液体阻力两方面的力的影响，当电 场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运 动，Date39两个带电颗粒能否分开，由两个颗 粒在电泳过程中的迁移率所决定，即U=dl Vt或d=UVt ldU= =VEtV l=dlVt或d1-d2=(U1-U2)Vt ld=Date40 迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位 电场强度下泳动的速度，可用下列公式计 算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒 泳动速度（cms-1）；E为电场强度（ Vcm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l 为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V ）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率 。 Date41影响电泳的因素 1、带电粒子的性质与电泳行为 2、电场强度对带电粒子迁移的影响 ：电场强度也称电位梯度，是指单位 长度（每一厘米）支持物体上的电位 降，它对泳动速度起着十分重要的作 用。一般，电场强