《生物大分子分离纯化技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物大分子分离纯化技术（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二章生物大分子分离纯化技术12.4. 生物大分子的色谱分离纯化技术22.4.1 高效毛细管电泳高效毛细管电泳(High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是荷电粒子在直流高压的作用下，在毛细管中迁移，从而进行高效、快速分离的一种电泳新技术。其分离是基于带电离子在电场中的不同的电泳淌度。它的基本原理与常规凝胶电泳或自由电泳并无本质的差别。所以，HPCE可以看成是一种仪器化程度比较高的电泳方式。3由于毛细管具有良好的散热性能，从而可以在毛细管两端加上高达30000 V 的高压、分离可以在很短时间内完成，分离效率非常高。这种方法所需样品体积只有
2、L-nL级。所以，HPEC法的特点为：高效、快速、微量、易于实现自动化，而且溶剂消耗少、环境污染小等等。4仪器HPCE仪器的基本组成如图所示，它由毛细管，带电极的容器，高压直流电源，进样系统，检测器及 数据采集和记录系统组成。比较先进的HPCE仪器还 配有毛细管恒温设备，自动采样器，微制备组分收 集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。561毛细管HPCE在毛细管中进行，管内径一般在25100m之间，外径在100400m之间长度为0.11m。除了石英毛细管外，玻璃、聚四氟乙烯(PTPE)及聚氟乙烯-丙烯毛细管也有使用。72进样系统为了保证HPCE分离的高效性，进样系统应尽量把nL-pL级的样品
3、以最短的样品区带引入到毛细管中。一般可采用电动法或流体力学法。83高压直流电源高压电源需提供高达30 kV的直流电压。检测器位于毛细管的接地端，电流在3300 A之间。电源应能以恒电压或恒电流(ITP)或恒功率的方式工作，其稳定件应达到设置值的0.1%。另外，电源的正负极应可以切换，以适应带不同电荷的样品的分离。94检测HPEC这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测器的高灵敏度，实际已经采用的检测器类型有多种。10HPEC中的主要检测技术检测原理 最低检出浓度(mol/L) 最低检出量 适用范围紫外可见吸收法 10-610-4 10-1510-13 通用/特殊情况基于一般光源的荧光法 10-81
4、0-5 10-1810-13 特殊情况基于激光的荧光法 10-1210-9 10-2110-18 特殊情况热光吸收法 10-810-5 10-1710-14 通用/特殊情况折射率法 10-710-5 10-1610-14 通用电导法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况安培法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况质谱法 10-910-5 10-1710-15 通用放射测定法 10-910-7 10-1910-17 特殊情况11分离模式HPCE的操作模式有多种，如毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)；毛细管等速电泳(Ca
5、pillary Isotachophoresis，CITP)，毛细管胶束电动色谱(Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography，CEKC)；毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)和毛细管等电聚焦法(Capillary Isoelectric Focusing，CIEF)等。12CZE是基于溶质在自由溶液中淌度差异的电泳分离方法，是目前应用最广泛的一种，如氨基酸、多肽及无机离子的分析，手性对映体分离，蛋白质纯度鉴定及构型研究等。13CGE主要在生物学上用于大分子的分离分析，如蛋白质和核酸。它是基于分
6、子的尺寸，让样品在合适的起分子筛作用的聚合物网孔内进行电泳分离。CGE可用于DNA序列分析，蛋白质分析。14pBR332 DNA的MSPI酶解片段混合物的CGE分离 (峰(bP)：1，26；2，34；3, 67；4, 76；5, 90；6, 110；7, 123；8、 9, 147, 10, 11，160；12，180；13，190；14，201；15，2I7；16，238； 17，242。缓冲液：TEB。进样：3s，30 mW。 TEB组成：89 mmol/L Tris, 89mmol/L 硼酸盐及2 mmol/L EDTA)。200V/cm，毛细管有效长度： 7cm，EB的浓度为1g/ml
7、15标准蛋白质的分离162.4.2 液相色谱法液相色谱是目前对生物大分子的分离纯化能力最强、效率最高、使用最广泛的手段之一。液相色谱大都在室温下操作，所用流动相可以用与生理液相近的缓冲水溶液。所用固定相的表面经过化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离分析提供了温和的条件，有利于保持生物大分子的构象和活性。17在生物大分子分离分析及纯化中最常用的色谱方法是空间排阻色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石(用于单链和双链DNA的纯化和鉴定)及液液分配色谱法。18核酸的色谱分离法19酶及蛋白质的各种分离纯化方法的比较201 排阻色谱排阻色谱(Size Exclusion
8、 Chromatography, SEC)也被称之为凝胶过滤色谱是20世纪60年代发展起来的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。21基本原理排阻色谱是依据分离样品物质分子大小而进行分 离的一种方法，其固定相由一种惰性的凝胶颗粒构 成，颗粒内部有许多网孔。颗粒和网孔的大小都可 以人为地去控制和选择。在分离过程中，比网孔大 的分子不能进入网孔的内部，它们只限于在凝胶颗 粒之间的流动相空间里向下流动，其流程短流动 速度快，而比网孔小的分子能扩散到网孔的内部， 因而向下移动时所经历的流程长，下行速度慢。最 终所产生的结果是：分子越大移动的越快，从而达 到大小不同分子间的分离。 2223凝胶色谱的
9、物理特性1凝胶颗粒的大小和形状层析用凝胶的形状均为球形，内部具有高密度 网孔，并能形成均一的柱床。2排阻极限(Exclusion Limit)排阻极限指不能扩散进入凝胶颗粒网孔内部的 最小溶质分子的分子量大小。排阻极限的涵义是 能有效分离一定形状分子的分子量最大极限。大 于这一极限的所有分子，都在同一区带内被快速 洗脱出。典型的葡聚糖凝胶Sephadex G-50(G 50)排阻极限为3.0104243分级分离范围(Fractionation Range)该物理性质表示某种凝胶允许溶质分子量在 多大范围内能得到线性分离。 如上所述的G50的分级分离范围为1.5103 3.0104。4. 得水率
10、(Water Regain, Wr)每1g干凝胶吸收水的克数就叫得水率。对G50 凝胶，其得水率为5.00.38，这个数值只表示吸进 凝胶颗粒内部的水分，不包括凝胶周围的水分。255床体积(Bed Volume) 每1g干凝胶吸水膨化后的最后体积就体积。6外水体积(Void Volume, V0) 凝胶装柱以后，凝胶周围所有空间的总体积就叫外 水体积。7洗脱体积(Elution Volume, Vc ) 指从柱床上将样品中某一物质洗脱下来所需洗脱液 的总体积。26在凝胶层析中，最常用的四种凝胶是：葡聚糖凝胶(Dextran)、聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamine)、琼脂糖凝胶(Agar
11、ose)以及后两者的复合凝胶。27凝胶排阻层析的应用凝胶排阻层折的用途非常多，主要有以下两个方面：(1)脱盐 在生物大分子纯化过程中，常要除去无机盐、有机溶剂及其它小分子杂质，利用凝胶排阻分离是一种廉价、简便又快速的方法；(2)生物大分子纯化 凝胶层析应用最为广泛的一个方面是生物大分子的分离和纯化，因为凝胶具有根据分子量的大小而分级分离生物大分子的能力。282 亲和层析(Affinity Chromatography)常规层析的不足大多数层析法都是依据样品物质和固定相之间的非特异性相互作用，如根据样品物质的电荷性质、大小、极性、分配系数、吸附等作用的差别进行分离的。由于选择性不够强，故分离效率
12、不高。29近年来又发展了一种新的层析法“亲和层析法”，又称特异配基层析法”。一些生物大分子能和高分子化合物发生特异性的化学反应，这些反应是可逆的、特异的。根据这一性质所进行的分离就叫亲和层析。与生物大分子可逆而又特异性结合的分子就叫配基。30基本原理亲和层析的原理可用一个亲和对来说明。如生 物大分子抗体可以与其对应的抗原发生如上所述的 亲和作用。若把抗原固定在类似于凝胶的固相载体 上得到亲和固定相，在进行层析分离时，抗体与抗 原间发生特异性的亲和作用，而其他的物质不能与 固定相结合。因而被洗脱出。然后用一种特殊的洗 脱剂把抗体从亲和柱上洗脱下来也可以固相抗体 来提纯、分离抗原。亲和层析已被广泛
13、地用于酶类 、运输蛋白、抗体、激素受体蛋白、药物结合蛋白 、核酸、神经递质蛋白以及其它生物大分子物质的 分离分析。3132抗体亲和层析纯化示意图33亲和层析的成败取决于精细的实验条件的选择，其中最主要的是制备带有共价结合配基的固定相以及洗脱条件的优化。34亲和层析的固定相载体必须符合以下要求(1)在实验条件下具有化学及物理稳定性(2)非特异性吸附要尽可能小；(3)具有均匀的网状空隙结构；(4)具有和配基结合的活性基团。35亲和色谱的应用基于羟基磷灰石固定相的亲和色谱可用于单链和双链DNA的纯化和鉴定。DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的相互作用。洗脱时用磷
14、酸缓冲液，核酸分子的 亲和性受其分子中磷酸基团的控制。单链DNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，其亲和性要小。杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和性适中。因此，单链DNA分子的结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。363 离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography, IEC)是生物大分子分级分离的最可靠的方法之一，它分离蛋白质、核酸等是依据生物大分子的电 荷特性，因而依赖于系统的pH及分离物质的等电点(pI)。当缓冲溶液的pH高于生物分子的pI时，应采用阴离子交换树脂，反之，应采用阳离子交换树脂。生物大分子非常小的电荷差异都可以用IEC法分离开。374 反相疏水作用色谱法反相色谱(Reverse-phase Chromatography, RPC)及疏水作用色谱(Hydrophob
