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1、感染性疾病病原体快速诊断感染性疾病病原体快速诊断 - -非培养技术临床应用非培养技术临床应用 概概 述述 感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病起人体发生感染并出现临床症状的疾病, ,主要表现主要表现为发热为发热。 病原体：细菌（含病原体：细菌（含TBTB）、）、支原体支原体、衣原体、衣原体 病毒病毒 真菌真菌 原虫等原虫等 机遇与挑战并存机遇与挑战并存 感染病因的复杂感染病因的复杂 免疫力低下的人群急剧上升免疫力低下的人群急剧上升 全民关注感染问题全民关注感染问题 相关部门的重视相关部门的重视 未知病原的鉴定
2、未知病原的鉴定 临床要求有效时间内的有效报告临床要求有效时间内的有效报告 细菌检验人员技术面和设备不能满足临床要求细菌检验人员技术面和设备不能满足临床要求 信任危机信任危机 现代感染的特点现代感染的特点 新感染性疾病新感染性疾病:SARS、禽流感、猪流感、禽流感、猪流感 已被征服的疾病卷土重来：结核、性病、炭疽已被征服的疾病卷土重来：结核、性病、炭疽 低免疫人群急剧上升：艾滋病、移植患者低免疫人群急剧上升：艾滋病、移植患者 动物微生物向人类的袭击动物微生物向人类的袭击 细菌耐药、经验性用药失败、细菌培养阳性率低、细菌耐药、经验性用药失败、细菌培养阳性率低、 细菌报告至少细菌报告至少3天，离天，
3、离8h出报告相差很远出报告相差很远 病原学检测基本程序病原学检测基本程序 正确、规范正确、规范采集和运送标本采集和运送标本 显微镜对标本或组织中的病原体的显微镜对标本或组织中的病原体的形态学形态学检查检查 病原体的病原体的分离培养和鉴定分离培养和鉴定 用免疫学技术对病原体用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体抗原或相应抗体的检测的检测 用分子生物学方法对病原体用分子生物学方法对病原体特异性基因特异性基因的检测的检测 6 白细胞计数与分类 血沉 C-反应蛋白（CRP） 白介素-6 降钙素原降钙素原 内毒素内毒素 分子生物学技术分子生物学技术 细菌感染非培养检测技术细菌感染非培养检测技术 结核感染的非
4、培养检测技术结核感染的非培养检测技术 结核夹层杯技术结核夹层杯技术 免疫斑点法：免疫斑点法：T T- -SPOT.TBSPOT.TB 分子生物学技术：分子生物学技术：Gene expertGene expert 血清学 检测 抗原 检测 抗体 检测 （1-3）-D葡聚糖 （Glucan, G试验） 真菌筛查 曲霉半乳甘露聚糖 (Galactomannan ,GM试验) 曲霉菌属 隐球菌荚膜多糖 （Gal, GXM试验） 隐球菌属 念珠菌甘露聚糖 （Mannan, Mn试验） 念珠菌属 曲霉菌IgM、IgG抗体 念珠菌IgM、 IgG抗体 真菌感染的非培养检测技术真菌感染的非培养检测技术 曲霉菌
5、属 念珠菌属 Wenen LIU 9 第一部分：细菌快速诊断第一部分：细菌快速诊断 降钙素原检测 内毒素检测 分子诊断 10 降钙素原降钙素原 PCTPCT 血清降钙素(CT)的前 肽物质 分子量：14.5 kDa 由116个氨基酸组成 的糖蛋白质 无激素活性 1111号染色体上号染色体上 的单拷贝基因的单拷贝基因 转录转录 甲状腺滤泡细胞甲状腺滤泡细胞 降钙素原前降钙素原前体体 内源多肽酶内源多肽酶 降钙素原降钙素原 PCTPCT 分解分解 细胞内特殊细胞内特殊 蛋白酶蛋白酶 正常情况下正常情况下 降降 钙钙 素素 11 全自动快速定量法全自动快速定量法 仪器：法国梅里埃公司VIDAS 全自
6、动酶联荧光分析仪及配套 试剂 标本要求：静脉抗凝血 注意无菌操作，使用新鲜标本， 如果4小时内不使用，应将标 本放置-20保存。 血浆中的PCT非常稳定，收集 标本24h后，PCT浓度在室温 下大约下降12，在4大约 下降6 不同人血浆PCT的医学决定水平 对象 PCT (ng/ml) 健康人 2(通常通常10-100) Wenen LIU 13 细菌感染诊断及严重程度判断细菌感染诊断及严重程度判断 脓毒性休克 严重脓毒症 系统性感染(脓毒症) 局部感染 正常值 PCT的浓度随感 染的扩散和感 染严重程度的 加重而升高 14 细菌内毒素细菌内毒素 革兰氏阴性菌细胞壁上革兰氏阴性菌细胞壁上 的一
7、种脂多糖（的一种脂多糖（LPSLPS）和）和 蛋白的复合物，细菌死亡蛋白的复合物，细菌死亡 或自溶后释放或自溶后释放 进入机体将会出现发热、进入机体将会出现发热、 血压降低、寒颤、引起血压降低、寒颤、引起 DICDIC、内毒素败血症等一、内毒素败血症等一 系列临床反应。系列临床反应。 Wenen LIU 15 16 细菌内毒素检测细菌内毒素检测 原理：仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取当OD 上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点在反应曲线 上的位置为浊度开始快速变化的时期，该取值能够快速、 稳定的获得反应时间，从而判断内毒素的含量 动态浊度法 Wenen LIU 17 仪器和试剂仪器
8、和试剂 BET-24A细菌内毒 素分析仪 MB-80微生物快速 动态监测系统 Wenen LIU 18 标本要求标本要求 患者早上尚未进行药物静脉治疗时: MB-80：“无热源真空采血管”,静脉抗凝血 ，采血量 2-4ml ，30min内送检 BET-24A：抽取1mL静脉抗凝血，配1mL1号处理液 其它体液如脑脊液胸腹水与血标本要求相同。 注意无菌操作 Wenen LIU 19 内毒素活性定量检测意义内毒素活性定量检测意义 G-所致脓毒症早期鉴别诊断 指导抗生素正确使用 判定抗感染治疗效果 帮助判断患者的预后 Wenen LIU 20 内毒素定量检测的适应症内毒素定量检测的适应症 各种急、慢
9、性病理性发热患者 各种类型“中重度感染、肝病、休克、肠道疾病、 脏器功能衰竭、大手术术后”患者 慢性疾病长期卧床、免疫力低下患者 急诊及ICU病房收治的生命体征不稳定的患者 细菌内毒素检测细菌内毒素检测 方法：鲎试验法 原理：仪器检测试管内反应物的光密度OD值，取 当OD上升到0.02的点的时间作为反应时间，该点 在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期， 该取值能够快速、稳定的获得反应时间，从而判 断内毒素的含量。 细菌内毒素检测细菌内毒素检测 自动化仪器：MB-80微生物快速动态检测系统 标本要求：静脉抗凝血，“无热源真空采标本要求：静脉抗凝血，“无热源真空采 血管”，血管”，采血量2-
10、4ml ，30min内送检 其它体液如脑脊液胸腹水与血标本要求 相同。 注意无菌操作注意无菌操作 血浆内毒素测定的临床应用血浆内毒素测定的临床应用 (1)革兰阴性菌败血症的诊断 (2)呼吸道感染 (3)肝脏感染及肝硬化 (4)胆道疾病 (5)急性胰腺炎 (6)溃疡性结肠诊断、治疗和预后判断 (7)原因不明的发热 (8)外源性输注的内毒素血症的诊断炎 (9)细菌性感染的辅助性 分子诊断技术检测耐药致病菌流程分子诊断技术检测耐药致病菌流程 PCR技术扩增23rRNA基因以对常见致病菌进行分型 革兰阳性球菌 革兰阴性杆菌 mec A基 因 Van A 、VanB 基因 PBP2b 基因 PCR扩增耐
11、药 基因特异性基因 ESBLs 基因 AMPc 基因 碳青霉烯 酶基因 mecA：耐甲氧西林葡萄球菌属（MRS）特异性基因 Van A VanB ：耐万古霉素肠球菌（VRA）特异性基因 PBP2b ：青霉素不敏感肺炎链球菌（pNSSp）特异性基因 ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXA AMPc基因包括质粒介导型和染色体诱导型。其中前者主要包括MOX、CMY、 DHA、ACC、ACT、FOX等亚型，后者主要包括： ADC。 碳青霉烯酶基因：A类酶，以KPC为代表；金属酶，以IMP、VIM、NDM为 代表；D类酶，以OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48为主。
12、 第二部分第二部分 结核分枝杆菌的快速诊断结核分枝杆菌的快速诊断 结核夹层杯技术 结核感染T细胞检测技术 分子生物学技术 结核病是全球严重的公共卫生问题之一。结核病是全球严重的公共卫生问题之一。 据据WHO估计，全球有约估计，全球有约20 亿人感染结核分枝杆菌，每亿人感染结核分枝杆菌，每年有约年有约200万人死于结核。万人死于结核。 我国是世界上我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上。倍以上。 结核病的临床表现多样，可以累积全身各个系统，尤其结核病的临床表现多样
13、，可以累积全身各个系统，尤其是肺外结核病变往往十分隐匿，给临床诊断带来极大的是肺外结核病变往往十分隐匿，给临床诊断带来极大的困难。困难。 研究背景研究背景 肺外结核 结核分枝杆菌能侵染全身大部分器官，其中有结核分枝杆菌能侵染全身大部分器官，其中有20%20%发生在肺外。发生在肺外。 结核分枝杆菌结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌。它可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。 结核分枝杆菌感染后机体的免疫应答根据结核感染的状态，人群可以分为无结核感染、活动性结核、潜伏性结核和治愈。 结核分枝杆菌生长缓慢生长缓慢，一般需24周长成肉眼可见的菌落。因此，快速诊断对TB至关重要。 研究背景研究背景 Wene
14、n LIU 29 结核夹层杯技术结核夹层杯技术 原理原理：通过专用消化灭活液消化组织细胞和粘蛋 白等，将结核杆菌裸露出来，并结合高速震荡， 使痰标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀 于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夹层杯中直接抗 酸染色、干燥，并用取片针顶出内底，经封片等 步骤后，镜下检测抗酸杆菌。 Wenen LIU 30 检测流程示意图检测流程示意图 Wenen LIU 31 镜下比较镜下比较 图图2. 2. 夹层杯法（新方法）：夹层杯法（新方法）： 菌量多，背景清晰，易于观察菌量多，背景清晰，易于观察 图1. 直接涂片法（传统方法）： 菌量少，背景不清晰 Wenen LIUWenen LI
15、U 3232 夹层杯诊断技术的优点夹层杯诊断技术的优点 阳性率高阳性率高 背景清晰，易于观察背景清晰，易于观察 易于标准化易于标准化 检测速度快检测速度快 生物安全性好生物安全性好 夹层杯诊断夹层杯诊断 技术的优点技术的优点 Wenen LIU 33 结核夹层杯技术结核夹层杯技术 标本要求： （1）痰液要求新鲜，留取清晨深咳出的第一口痰液， 留痰时，患者以清水漱口次，然后用力咳出气 管深处的痰 （2）用氢氧化钠处理完全。 临床应用：用于结核分枝杆菌的初筛 活动性结核与潜伏性结核 接触活动性结核病 患者 暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫 力清除 -没有症状,结核杆菌仍 旧存在而不能被侦测 - X
16、-光/ CT 扫描显示 正常 -没有抗体应答 -诊断困难 -传统的结核感染检测 只有PPD 机体被感染 受免疫抑制受免疫抑制 没有临床症状没有临床症状 终身处于感染状态 潜伏性结核潜伏性结核 有临床症状有临床症状 具有传染性具有传染性 -结核杆菌可以通过 涂片、培养检测出 -胸部的 X-光或 CT 扫描显示异常 -肺外结核难以诊断 (特别是儿童) 活动性结核活动性结核-结核病结核病 5% 5% 再次激活再次激活 T-SPOT.TB 列入美国、英国等欧美列入美国、英国等欧美20多个国家结核诊疗指南多个国家结核诊疗指南 美国美国CDC推荐：推荐：BCG接种人群结核感染检测首选接种人群结核感染检测首选 国内风湿科国内风湿科/消化科指南消化科指南
