细胞生物学-细胞调亡

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1、一、凋亡概念的形成： 1965年澳大利亚科学家Kerr发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞,这些细胞 体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬,机 体无炎症反应。1972年Kerr提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始,在此之前，关于胚胎发育 生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概 念的提出奠定了基础。细胞凋亡定义:是指为维持内环境稳定, 由基因控制的细胞自主的有序的结束生命的过程。细胞凋亡(Apoptosis)蝌蚪向蛙发育的变态反应发育过程中手和足的成形过程发育中神经细胞数量的调节诱导细胞调亡的因子物理性因子，包括射线（紫外线，

2、 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等 。 细胞凋亡形态变化特征 （1）凋亡的起始；微绒毛的 消失，细胞间接触的消失，与 周围的细胞脱离，染色质固缩 . 沿着核膜分布。（2）凋亡小体的形成。核膜 核仁破碎，核染色质断裂为大 小不等的片段，与某些细胞器 如线粒体一起聚集，为反折的 细胞膜所包围。（3）凋亡小体逐渐被周围专 职或非专职吞噬细胞吞噬。A、Normal cell B、Apoptosis: Apoptotic bodies胸腺细胞 正

3、常凋亡是细细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质质）、物理因素（如热热、辐辐射）和生物因素（如病原体）等环环境因素的伤伤害，引起细细胞死亡的现现象。 细胞坏死早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。细胞凋亡与 坏死(necrosis)ApoptosisNecrosisDeath by apoptosis is a neat, orderly process细胞凋亡与坏死的区别胞浆内Ca2+浓度升高。 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp 特征性的DNA ladders 。细胞凋亡的生化特征Apoptosis indu

4、ced by Cyto CLane 10 h21 h32 h43 h54 h6Control7Marker凋亡细胞 tTG（组织转谷氨酰胺酶 ）积累并达到较高水平形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察细胞凋亡的检测Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process（488nm 400） 电镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩，核内染色质高 度盘绕，出现许多空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解 为碎块，产生凋亡小体。 磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期 ，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环

5、境中。Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂 结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS。将 Annexin-V进行荧光素（FITC）或biotin标记，以 标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生 。磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine PS）外翻分析 （Annexin V法）Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinVDNA片段化分析细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核

6、苷 酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。TUNEL测定法是terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling的缩写，意 指末端脱氧核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端标记 测定法。这一方法能对DNA分子中3-OH断裂缺口进行 原位标记。凋亡细胞的核DNA中产生的3-OH末端， 可藉助一种可观测的标记物，如荧光素进行原位标记 ，并用荧光显微镜进行观察。 TUNEL测定法: 即DNA断裂的原位末端标记法细胞凋亡的基因调控机制最先是从线虫（ c.elegans）研究开始的(MIT: R

7、obert Horrid , 1986)。 线虫是一种细胞定数细胞，在个体发育中，成体的1090 个体细胞中，有131个注定是要自然凋亡。三、细胞凋亡的分子机制C elegans: a mm, transparent body only a few cell types, from zygote to mature adult only in 3.5days.1、与PCD有关的基因，负责PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。CED-3是一个蛋白酶，激活的CED-3 可以水解靶蛋白从而使细胞死亡，是 细胞杀手； Ced-4对ced-3引起的体细胞凋亡起促进作用。ced-9可抵消ced

8、-3的作用，防止细胞被杀死，在ced-3和ced-4的杀死细胞作用中起负调控。2、与PCD过程吞噬作用有关：ced-1、ced-2、ced-5-8 和 ced-103、核酸酶基因（nuc-1）, 控制DNA降解，但非PCD所必须。4、影响特异细胞类型PCD的基因：ces-1、ces-2和her-1. 线虫体细胞凋亡研究：PCD相关基因15个，分为四组保守性高，在哺乳动物中有相应同源物：Ced-3=ICE, Ced-4=Apaf-1, Ced-9=Bcl-2.所有的动物细胞都有一种相类似的细胞凋亡的机制，即通过一个蛋白酶家族的介导。动物细胞中的凋亡效应分子CaspaseCaspase家族家族Ca

9、spase:天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶Why called caspase?Active site: Cysteine Cleavage site: Asparatic acid Cysteine Asparatic acid specific proteaseAsp-Xxx起始者 Caspase执行者 Caspase有两类caspase，一类是起始者，如caspase-8、9 ,10 ;另一类是执行者，如caspase-8可依次激活caspase-3 、6、7。Caspase家族的分类所有的caspase都以非活性的形式存在 ProcaspasesCaspases酶原包含三个结构域：

10、NH2末端结构域、约20KD的大亚基和约10KD的小亚基。 Caspase家族的级联反应在诱导细胞凋亡信号的作用下通过自我切割而激活。激活后又可激活 家族中的其他成员，引起蛋白质酶解的级联反应。最后，被激活的蛋白酶 切割了细胞与细胞凋亡相关的关键蛋白，如核纤层蛋白，从而引起凋亡。（1）蛋白激酶：如粘着斑激酶(FAK)、PKC以及Raf1。（2）核纤层蛋白：导致核纤层解体、核被膜浓缩。（3）细胞结构蛋白：如中间纤维、肌动蛋白，导致细胞形态的改变。（4）与DNA修复相关的酶类:使合成的DNA难以保证正确，导致细胞调亡。（5）caspase激活的DNase抑制蛋白：将内切核酸酶 DNase的抑制蛋白

11、水解，导致这种酶被激活，将DNA切割成片段。能够被caspase切割的靶蛋白包括以下几类：（一）细胞凋亡相关基因和蛋白细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原 癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有Fas、 ICE、Apaf-1、 Bcl-2等。1、fas 属TNF受体家族。Fas 基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T 和B 淋巴细胞，巨噬细胞以及卵巢细胞等。Fas 蛋白与Fas 配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。2、ICE：白介素-1 转换酶（Interleukin-1 -converting enzyme）基因，该酶能将白介素前体切

12、割为活性分子， 是一 类Caspase，能选择性降解蛋白质。ICE蛋白酶参与Fas诱导 的细胞凋亡，与线虫细胞凋亡基因ced-3同源。3、Apaf-1 ：(apoptotic protease activating factor-1)，是ced-4在哺乳动物中的同源体为Apaf-1 ，能激活Caspase3 ，这一过程需要细胞色素c的参与。 基因产物功 能 BCL-2凋亡抑制剂，可和Bax及Bak结合BCL-x其L型抑制凋亡，S型促进凋亡，与Bax及Bak结合BCL-w凋亡抑制剂 Bax凋亡促进剂，可与BCL-2，BCL-XL，EIB19K结合Bak凋亡促进剂，亦可作抑制剂，可与BCL-2，B

13、CL-X和E1B19K结合MCL-1凋亡抑制剂 Bad凋亡促进剂，与BCL-2和BCL-XL结合Ced-9线虫中的凋亡抑制剂，BCL-2同源物 E1B19K腺病毒凋亡抑制剂，与Bax和Bak结合名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma，bcl -2)主要存在于线粒体外膜上，是ced-9在哺乳类中的同源物。 是一个不断扩增的多基因家族，其在哺乳类中的家族成员有：4、bcl-2：当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面 信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，

14、Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径参与死亡受体信号转导的接头蛋白（死亡结构域蛋白 death domain protein）： TRADD：TNF 受体相关死亡结构域蛋白 FADD （Fas-associated death domain） ：Fas 相关 死亡结构域蛋白。TNF激发细胞的程序性死亡的过程细胞内信号对程序性细胞死亡的激发细胞内源信号：DNA损伤、细胞质中Ca2+浓度过高、极度氧胁迫等也会激发细胞的程序性死亡，这些信号激活Bcl-2家族中的促凋亡前体蛋白Bad或Bax,使它们从胞质溶胶转移到线粒体外膜，导致外膜的通透性改变，使细

15、胞色素c全部从线粒体释放到胞质溶胶，与Apf-1(凋亡蛋白酶激活因子)、前体caspase-9等形成“凋亡体”（Apoptosome），将Caspase 9的激活。caspase-9激活下游的执行caspase3，7，作用于靶蛋白引起细胞的程序性死亡。线粒体介导的细胞 凋亡途径2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。Sydney BrennerH. Robert HorvitzJohn E. Sulston 名词:细胞凋亡 Caspase问答:细胞凋亡的主要形态学特征?细胞凋亡与细胞坏死的区别？复习题