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1、禽 流 感 病 毒-哈尔滨兽医所组员：王馥梅、郭莹莹、郭利敏孙芬芬、王亚欣、张美晶许傲天、黄文强、高立流感病毒的命名病毒粒子特点禽流感病毒是正粘病毒科流感病毒属的一个成员 。病毒颗粒呈球形、杆状或长丝状，为多形性 。直径为80一120 nm，表面有一层棒状和蘑菇状的 纤突，前者对红细胞有凝集性，称血凝素（HA ），后者有能将吸附在细胞表面上的病毒粒子 解脱下来的作用，称神经氨酸酶（NA）。纤突 的一端镶嵌在病毒的脂囊膜，囊膜下面有一层 膜蛋白，紧紧地包裹着呈螺旋状对称的核衣壳 。核衣壳的直径为915nm，由RNA、核蛋白 及三个多聚酶所组成。根据核糖核蛋白抗原性不同分为三个类型，即A、 B、C
2、三型。其中B、C两型仅能对人致病，A型可 对人、猪、马和禽致病。 依据病毒表面的两种糖蛋白血凝素和神经氨酸酶 可将A型流感病毒分成若干亚型。目前已有16种 HA和9种NA，不同的H抗原或N抗原之间无交叉反 应。核酸为单股负链RNA，分为8个不同的片段，在核 酸外面包被着螺旋排列的壳粒，主要是由核蛋 白(NP)构成。 8个核酸片段：A 型和B 型AIV中,1 个6 个片段均编码单个蛋白 ,分别为PB2 、PB1 、PA 、HA 、NP 和NA ;第 7 个和第8 个片段均编码2 个蛋白,分别为M1 、 M2 和NS1 、NS2 。这10 个病毒蛋白中,有8 个 是病毒粒子的组成成分( HA、NA
3、、NP、M1 、 M2 、PB1 、PB2 和PA) ,分子质量最小的RNA 段编码2 个非结构蛋白,即NS1 和NS2 。流感病毒病毒有囊膜，对乙醚、氯仿、丙酮等脂溶剂敏感 。20%乙醚4处理2h 可使病毒裂解，但血凝滴度不受 影响。常用消毒药容易将其灭活，如福尔马林、-丙内 酯、去氧胆酸钠、稀酸、氨离子、卤素化合物(如漂白 粉和碘剂等)、重金属离子等都能迅速破坏其传染性。 禽流感病毒对热比较敏感，65加热30分钟或煮沸 (100) 2分钟以上均可灭活。病毒在粪便中存活1周， 在水中可存活1个月，在pH 4.1的条件下也具有存活能 力病毒对低温抵抗力较强，在有甘油保护的情况卜，可 保持活力1
4、年以上。病毒在直接阳光下40-48小时即可灭 活，紫外线直接照射，可迅速破坏其传染性。对冻融作 用相对较稳定，但反复冻融，最终可使病毒灭活。 流行病学 禽流感病毒在自然条件下，能感染多种禽 类 。病毒在这些野禽中大多形成无症状 的隐性感染，而成为禽流感病毒的天然贮 毒库。 家禽中以火鸡最为敏感，鸡、雉鸡、鸽、 鹌鹑、鹧鸪、鸵鸟等均可受禽流感病毒的 感染而大批死亡。 过去一般认为，人只能在实验条件下才能 被禽流感病毒人工感染，但现在发现，禽 流感病毒能直接感染人，并可引起发病甚 至死亡。在实验室人工试验中，猪、水貂 、猴、猫等均可被禽流感病毒感染。 传染源：主要来自野生禽类（尤其是野生水禽） 、
5、受感染的家禽以及观赏鸟等。 传播途径：禽流感是高度接触性的传染病，可 通过多种途径传播感染，被感染禽群的粪便及 分泌物污染的饲料、饮水、空气中的尘埃以及 笼具、蛋品、种苗、衣物、运输工具，均可通 过各种渠道进入其他的健康禽群。带病毒的候 鸟和野生水禽在迁栖过程中，沿途可散播病毒 。观赏鸟、参赛的鸽子以及其它参加展览的鸟 类都可直接或间接将病毒散播到敏感禽群内。 与带毒的人或猪的接触也可能引起病毒的传播 。 该病一年四季均可流行，但以冬季和气温 骤冷骤热的季节更易暴发。 症状 产蛋鸡在感染H9N2等低致病力病毒后， 最常见的症状是产蛋率下降，但下降程度 不一。小鸭鸭流鼻汁症状 病鸭鸭的呼吸症状
6、肉鸡、未开产的种鸡和蛋鸡除没有产蛋下 降的变化外，其余的症状与上述产蛋鸡相 似。鸽、雉、珍珠鸡、鸵鸟、鹌鹑、鹧鸪 等感染低致病力禽流感后，临床症状与鸡 相似。 由高致病力毒株，如H5N1禽流感病毒感 染鸡后形成的高致病力禽流感，其临床症 状多为急性经过。 病鸡头部肿胀，冠和肉髯发黑，眼分泌物增多，眼结膜潮 红、水肿，拉稀粪。褪色蛋、无壳蛋、畸形蛋增多， 鸡脚鳞片下呈紫红色或紫黑色。少数病鸡出现神经症状， 包括转圈、前冲、后退、颈部扭歪或后仰望天等。 鸡鸡冠肿肿 胀胀坏死 ， 眼脸脸及 周围围高 度肿胀肿胀 鸡冠与肉 呈肿胀肿胀紫 绀绀 脚鳞鳞的紫变变 感染AIV的病鸡多呈脚鳞的紫变与鸡冠坏死、
7、 出血为本病的特征，本图所示者为脚膝关节 (图上方)周围的紫色变化 病鸭鸭角弓反张张 病变常见的肉眼病理变化为喉气管充血、出血 ，在气管叉处有黄色干酪样物阻塞，气囊 膜混浊，典型的纤维素性腹膜炎，输卵管 黏膜充血、水肿，卵泡充血、出血、变形 ，肠黏膜充血或轻度出血，胰腺有斑状灰 黄色坏死点。 腺胃乳头、腺胃与肌胃交界处、腺胃与食道交 界处、肌胃角质膜下、十二指肠黏膜出血。腺胃及肌胃出血 鸭鸭流感胰腺出血病变变 流感病毒的研究情况：1 病毒结构蛋白M2： M2基因包含1439 和728995两个部分,其初始 转录产物在剪切40727位的内含子后, 拼接成 成熟的mRNA后翻译成M2蛋白。M2蛋白
8、是97个氨 基酸的跨膜蛋白,大量表达于感染细胞表面,包 括细胞外氨基端(23个氨基酸残基) 、跨膜区 (2543氨基酸残基) 以及位于细胞内的羧基端 ( 54 个氨基酸残基) 。M2蛋白是一个相对较小的病毒成分,其生物活性形 式是一个寡四聚体。M2蛋白包括3个半胱氨酸残 基Cys217、Cys219 和Cys250,大多数M2 通过 Cys217和Cys219形成二硫键连接成M2二聚体,再 由非共价键连接形成同源四聚体,而Cys250 被酰 基 化。M2蛋白在病毒复制中具有重要作用,也是抗 病毒药物作用靶点 M2蛋白是重要的病毒抗原,在疫苗发展中具 有重要意义2 病毒非结构蛋白NS1： NS1
9、主要在核内,在感染的早期就被大量合成，A型 流感病毒NSl基因全序列为890个核苷酸,有两个 编码区。第1个编码区编码含202个237个氨基 酸的NSl 蛋白,在不同病毒株系间有差异。第2 个编码区编码含121个氨基酸的NS2蛋白,其5 端有56个核苷酸与NSl相同,整个mRNA 包含一个 中断的含473个核苷酸的区域。（1）NSl 蛋白对宿主细胞蛋白合成有抑制作用 研究表明,AIV 的NSl 蛋白具有RNA 结合活性,其 可以通过以下方式抑制宿主细胞蛋白的合成: 抑制宿主细胞mRNA 的多聚腺苷酸化; 与宿 主细胞内的多种蛋白质相互作用; 结合宿主细 胞发生多聚腺苷酸化的mRNA 并抑制宿主
10、细胞 mRNA的核输出; 与小核RNA 结合,阻断前 mRNA 的剪接过程（2）NSl 蛋白有利于病毒的合成与表达 AIV 的NSl 蛋白在与宿主细胞核蛋白相互作用,抑 制宿主细胞核内mRNA 输出的同时,也大大 提高了宿主细胞的前mRNA 在细胞核内的浓度与 寿命,因为病毒的帽依赖性内切酶能从宿主细胞前 mRNA 上将多聚腺苷酸帽子切下来并用来作为合 成病毒RNA 的引物,所以宿主细胞前mRNA 在细 胞核内的积累有利于病毒mRNA 的合成。（3）NS1 蛋白与宿主细胞凋亡的关系 NSl 蛋白通过上调表达PKR 细胞内抑制物的浓度 来抑制PKR 的激活,或是通过直接结合PKR 和 抑制IRF
11、23 ( IFN regulatory factor3 ,IRF3) ,来 抑制PKR 的激活,从而延缓细胞凋亡。（4）NS1 蛋白的干扰素及肿瘤坏死因子的颉颃作用 流感病毒NSl 基因在抑制干扰素、细胞因子和NF2B 通路 中发挥了关键性作用。 NS1 蛋白可作为一种鉴别诊断标志,通过检测抗NS1 蛋白 的抗体来区分野毒感染和疫苗免疫,并可作为早期感染 的依据。3 禽流感病毒抗原的变异与效应： （1）禽流感病毒抗原变异 1.1点突变 流感病毒的RNA复制酶缺乏校正阅读能力,编码HA和NA蛋 白质的基因非同义替换的积累使其基因容易发生突变而 发生抗原漂移. 流感病毒HA 基因的突变率较高,据估
12、计, 每个复制周期中每个核苷酸的突变几率为2 10- 3 ,也 就是说病毒每复制一代, HA基因上大约有一个碱基发生 变异.1.2基因重排 A型流感病毒是分节段、单股负连的RNA病毒,有8个基因 片段. 当2个或2个以上的不同病毒粒子同时感染1个宿 主细胞时,在病毒的增殖过程中,不同毒粒子的8个基因组 片段可以随机相互交换,从而发生核酸片段水平上的重 新组合,理论上通过基因片段的重排有可能产生256种遗 传不同的子代病毒. 在自然界,这种混合感染的现象比较 常见,例如日本在20世纪80年代和90年代曾从发生猪流 感(H3N2 , H1N1 )混合感染的猪群中分离到H1N2 基因 重组型流感病毒
13、. 通过基因重排有可能产生高致病力的 毒株,幸运的是,迄今为止,造成严重损失的均为H5 和H7 亚型.(2)禽流感病毒抗原变异引起的效应： HA受体结合位点变异 切割位点附近的氨基酸变异 HA切割位点附近的潜在糖基化位点改变4 致病机制：流感病毒的感染过程吸附、穿膜与脱壳与病毒表面蛋白血凝素有关 血凝素裂解为两个由二硫键连接的亚基（HA1与 HA2）是诱发感染的前提 流感病毒的受体结合部位(receptor binding site) 位于HA头部顶端 细胞受体是位于细胞膜糖蛋白或糖脂链末端的唾 液酸 血凝素结构流感病毒的复制及调控 只有当vRNA与NP同时存在时，vRNA才可转运 到细胞核内
14、 NP、RNA聚合酶亚基和NS1在感染后最初数小 时即生成 其他蛋白质如HA、NA、M1、M2和NS2合成较 晚 流感病毒在特定时间内合成的蛋白成分均要通 过宿主细胞的介入进入核内完成vRNP的组装 M1是vRNP向核外转运的动力，只有在细胞中 合成M1，并且进人细胞核后才发生vRNP的核 外转运 病毒的组装、成熟与释放 NP在细胞浆内合成后 ，很快进人细胞核 与vRNA结合形成核壳体 M1蛋白合成后到达细胞膜，紧贴于细胞 膜内侧面 病毒膜蛋白合成后先要进行结构上的修饰 和加工 ，然后被转移到宿主细胞膜上 病毒以出芽方式释放子代病毒颗粒 流感病毒感染发病机制 流感病毒感染和病毒复制主要在上呼吸
15、道 上皮细胞，但常引起机体局部炎症和全身 性反应 机体反应主要与炎症性细胞因子、趋化因 子、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、粘附分 子和微小纤溶酶表达与活化有关 激活p53和phosphatidylinositol 3 - kinase ( PBK) /Akt信号通路诱导病毒的增殖 诱导IKK-NF-B信号通路，利于病毒复制 直接激活Fas/FasL细胞凋亡信号，导致 细胞的凋亡 NS1蛋白能通过作用于其特定的靶目标, 例如NF-、PKR及IRF3等来激活干扰素 所诱导的连锁反应,从而促进细胞凋亡禽流感的诊断技术 禽流感的确诊主要依据实验室方法，实验室方 法诊断方法主要包括病原学，血清学和分子
16、诊 断三部分。病原学检测技术1病毒的分离培养 病毒的分离培养是检测禽组织中AIV 的一种经典、准确、 敏感的病原学诊断方法，可以作为AIV 检测的标准。 目前常用的方法有鸡胚分离培养和细胞培养。 缺点：检测周期长，操作程序繁杂，不适用于该病的快速 诊断。 2神经氨酸酶促试验利用AIV囊膜表面的NA能够水解含有N乙酰神经氨酸的 底物来检测病毒的存在与否。优点：特异性强，检测结果十分可靠。但该方法并未被广 泛应用到临床中血清学诊断技术血凝与血凝抑制试验神经氨酸酶抑制试验酶联免疫吸附试验免疫荧光技术中和试验琼脂扩散试验分子诊断技术 RT-PCR 和Realtime RT-PCR 荧光RT-PCR、 RT-PCR-ELISA 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA) 环介导的等温扩增技术(LAMP) 基因芯片技术防治措施 加强饲养管理，建立完善的生物安全体系 做好免疫接种, 增强机体特异抵
