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1、 实验目的学习并掌握DNA酶切、电泳技术学习掌握Southern杂交的原理和技术实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可 分为三类：类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化） 作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别 位点并随机的切 割识别 位点不远处 的DNA，而类酶在识别 位点上切割DNA分 子，然后从底物上解离。类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶）,它切 割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰 同一识别 序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组
2、DNA的基础。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷 酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列：5- GAATTC-3)，有少数 酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA片段(如Sma：5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧 ，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoR切割 识别序列后产生两个互补的粘性末端。5 5GAATTC CTTAAGGAATTC CTTAAGEcoRI5G CTTAA pAATTC G5 p5 5GAATTC
3、 CTTAAGGAATTC CTTAAGEcoRI5G CTTAA pAATTC G5 p5 5AGCT TCGAAlu I5AG TC pCT GA5 pAGCT TCGA酶切后平末端酶切后粘性末端DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制 性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染 物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在 吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐 浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓 度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随
4、后调节盐浓度， 再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成 后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积 无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶 于缓冲液后进行第二个酶切反应。酶切过程中的注意事项在酶切过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约 为0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶 切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量, 一般增加2-3倍,甚至更多,反应时
5、间也要适当延长。酶切过程中的注意事项DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列 位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式 表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性 繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不 可缺少的环节，近年来发展起来的限制性片段长度多态性(RFLP) 技术更是建立在它的基础之上。技术应用 DNA限制性内切酶酶切图谱目标DNA片段分析基因工程中外源DNA与载体的连接目标DNA片段分析基因工程中外源DNA与载体的连接DNA限制性内切酶酶切图谱Southern杂交建立酶切反应体系适量DNA2ul 10x限制性内切酶缓
6、冲液2ul 40 mmol/L spermidine1ul 100 mmol/L DTT限制性内切酶 2/ug DNA加ddH2O定容至20ul注意：酶、缓冲液等需置于冰上；反应中酶应该是最后 一个加入的试剂。37摄氏度保温1小时Southern杂交技术原理与流程Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建， 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及 PCR产物分析等方面有重要价值。基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按 碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由核酸分子 的高度特异性及检测方法的灵
7、敏性，综合凝胶电泳和核酸内切酶的 分析结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出 DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的 特殊要求，还必需掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。这类 数据资料均可应用Southern杂交技术获得。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：1、将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到 一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即 印迹（blotting）；2、固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温 度和离子强度下退火，即分子杂交过程。Southern印迹杂交基本方法及主要步骤一、 待测核酸样品的制备（一）制备待测D
8、NA（二） DNA限制酶消化二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品三、电泳凝胶预处理四、转膜五、探针标记六、预杂交（prehybridizafion）七、Southern杂交八、洗膜九、放射性自显影检测1天1天1天1天2天1天3-7天琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品0.9%琼脂糖凝胶电泳建议大家使用大胶进行电泳20-30V电泳(过夜电泳)Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长 短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制 备DNA样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA样品放在0.8 1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电
9、泳可分辨70 80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。转 膜DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了进行有效地实现 Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。超过10kb的较大的 DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为了 使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段 控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此 ，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后， 移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段， 再用中性PH的缓冲液中和凝胶中
10、的缓冲液。探针标记预杂交（prehybridizafion）Southern杂交用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段 或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地 高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标 记没有，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4 多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随 机引物法、切口平移法和末端标记法。将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程 。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜 上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。转印后的滤膜在预杂交液中温育4-
11、6h，即可加入标记的探针DNA（探针DNA预 先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子 强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜，然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子 强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序 之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交还需注意的关 键一步就是洗膜。在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检 测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1- 2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2SSC中2min，取出膜，用 滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜 之间不能有气泡。洗 膜放射性自显影检测1 将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。2 在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定， 合上暗盒。3 将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强 弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 4 从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后 冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝 光时间，再洗第二张片子）。Thank you !
