酶工程 5 化学修饰

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1、第五章 酶分子的化学修饰酶分子化学修饰在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相 容性的物质进行共价连接，从而改变 酶的结构和性质。这些化学物质称为 修饰试剂，酶化学修饰主要用于基础 酶学的研究和疾病治疗。酶化学修饰的应用领域=在基础酶学研究上4探测酶活性必需氨基酸的性质和数目4酶蛋白一级结构的测定4酶蛋白的结构变化与运动4酶蛋白部分区域的构象状态4酶的作用机理与催化反应历程4酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态4酶的固定化技术4酶纯度的分析与检测=在疾病治疗上4克服酶在体内的不稳定性 4消除或降低酶的抗原性4有助于酶分子到达并集中于病灶部位=在工业上的应用4酶稳定性提

2、高，使生产成本降低4反应条件的改善和酶寿命的延长导致 生产工艺的技术革新和改进。大多数的化学修饰的目的在 于人为地改变天然酶的某些性质 ，创造天然酶所不具备的某些优 良特性甚创造出新的活性，扩大 酶的应用范围。酶经过修饰后，会产生各种各样 的变化，概括起来有：提高生物活性（包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变） 增强在不良环境中的稳定性； 针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性； 产生新的催化能力。主要内容第一节 酶分子的化学修饰方法 第二节 酶化学修饰的基本要求 第三节 修饰酶的化学性质酶的化学修饰的基本原理大量研究表明，酶分子表面外形 的不规则、各原子间极性和电荷的不 同、各氨基酸

3、残基间相互作用等使酶 分子结构的局部形成了一种包含了酶 活性部位的微环境，不管这种微环境 是极性的还是非极性的，都直接影响 到酶活性部位氨基酸残基的电离状态 ，并为活性部位发挥催化作用提供合 适的条件。但天然酶分子中的这种微环境 是可以通过人为的方法进行适当的 改造，通过对酶分子的侧链基团、 酶分子的功能基团等进行化学修饰 或改造，就可以获得结构或性能更 合理的修饰酶。酶经过化学修饰后，除了能减少 由于内部平衡力被破坏而引起的酶分 子伸展打开外，还可能会在酶分子的 表面形成一层“缓冲外壳”，能在一定 程度上抵御外界环境的电荷、极性等 变化对酶分子的影响，进而维持酶活 性部位微环境的相对稳定，使

4、酶分子 能在更广泛的条件下发挥作用。酶化学修饰的基本原则都是 充分利用化学修饰剂所具有的各 类化学基团的特性，或直接或间 接地经过一定的活化过程与酶分 子中的某种氨基酸残基（通常选 择非酶活必需基团）产生化学反 应，从而对酶分子的结构进行改 造。在酶的化学修饰过程中需要 涉及被修饰酶、修饰剂的性质以 及修饰反应条件的选择。一般在开始设计酶化学修饰反应时须对被 修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性质 等应尽可能全面掌握。在此基础上选择合适的化学修饰剂进行化 学修饰，在选择化学修饰剂时，除了需要考虑 修饰剂的种类、修饰剂上的反应基团的数目和 位置以及修饰剂上反应基团的活化方法和条件 以外，还需要

5、考虑修饰剂的分子量等其它可能 会影响修饰反应的因素。值得注意的是酶的修饰反应 一般总是尽可能在酶稳定的条件 下进行，需要尽可能少破坏酶活 性功能的必需基团，以提高酶和 修饰剂的结合率和酶活回收率。酶的化学修饰反应条件主要包括体系中酶与修饰剂的分子比例、 反应体系（包括溶剂性质、盐浓度以及pH等） 反应温度和时间等一般来说，修饰反应条件随酶的性质 、修饰剂的种类、修饰反应的类型等的不 同而不同，一个合适的修饰反应需要由大 量的实验来予以确定。第一节 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法酶的表面修饰 酶分子的内部修饰 与辅因子相关的修饰 金属酶的金属取代酶的表面修饰化学固定化 酶的小分子修饰作

6、用 酶的大分子修饰作用大分子非共价修饰大分子共价修饰 分子内交联 分子间交联 脂质体包埋 反相胶团微囊化：酶的表面修饰（一）化学固定化一般是直接通过酶表面的氨基酸 残基将酶分子共价连接到惰性载体上 ；由于载体的引入，使酶所处的微环 境发生改变，进而改变了酶的性质， 特别是动力学性质发生了改变。（二）酶的小分子修饰作用主要是利用一些小分子修饰试剂，通 过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO -、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高 酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙 基、糖基和甲基等。酶的表面修饰（三）酶的大分子修饰作用非共价修饰共价修饰大分子非共价修饰利用一些大分子试剂通过与酶非共

7、价相互 作用，对酶进行有效的保护 例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定 于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连 ，从而保护酶的活力；一些多元醇、多糖、多 聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保 护酶活力；另外一些蛋白质可以通过相互作用 ，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使 酶的稳定性增加。大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价 键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖 层，形成的可溶性酶具有许多有用的性 质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物 歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除 酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了半衰期，从而提高了药效。（四）分子内交联增加酶分子表面的交联键

8、数 目是提高酶稳定性的有效方法之 一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基 经过羰二亚胺活化后，可以与一 系列二胺发生作用，使酶的稳定 性得到改善。（五）分子间交联利用一些双功能或多功能试剂将不同 的酶交联在一起形成杂化酶。例如用 戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交 联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的 自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶 交联形成的杂化酶可作为部分代谢途 径的模型。（六）脂质体包埋一些医药用酶，如 SOD、溶菌酶等， 由于分子量较大，不易进入人体细胞内， 而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应 ；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。脂 质体是天然脂类或类固醇组成的 微球体 ，酶分子包埋在其内部，可以通

9、过与细胞 膜的融合或内吞作用而进入细胞内。（七）反相胶团微囊化近年来发展起来的酶在有剂相中进行 催化的技术，反相胶团中酶的稳定性 大大提高。 一些表面活性剂溶解在非极性有机溶 剂中时可自发地形成近似球状的反相 胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水 尾部朝外而极性头部朝内的微胶团， 其内部可容纳一定量的水，酶溶解在 其中避免变性。加H2O疏水尾部 亲水头部加酶液S PEEE图：反相胶团的结构和酶的分布酶分子的内部修饰非催化活性基团的修饰酶蛋白主链的修饰催化活性基团的修饰肽链伸展后的修饰（一）非催化活性基团的修饰通过对非催化残基的修饰可以改 变酶的动力学性质，改变酶对特殊底 物的亲和力；通常可被修饰的

10、氨基酸 残基既可以是亲核的，也可以是亲电 子的，还可以是可氧化残基。（二）酶蛋白主链的修饰主要是靠酶法进行修饰，用 蛋白酶对主联进行部分水解，可 以改变酶的催化特性。（三）催化活性基团的修饰通过选择性修饰催化活性氨 基酸的侧链来实现氨基酸残基的 取代，使一种氨基酸侧链转化为 另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。（四）肽链伸展后的修饰酶蛋白经过脲、盐酸胍处理 ，使肽链充分伸展，对酶分子内 部的疏水基团进行修饰，然后在 适当条件下，重新进行折叠。三、与辅因子相关的修饰对依赖辅因子的酶可用两种方法 进行修饰： 如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因子共价结合于酶分子上； 引入新的具有更强

11、反应的辅因子四、金属酶的金属取代酶分子中的金属离子可以被其他 金属离子取代，可以改变酶的专一性、 稳定性等。第二节 酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质（一）酶的稳定性：（二）酶活性中心的状况：（三）酶侧链基团的性质与反应性 二、修饰反应的条件：（一）pH与离子强度（二）修饰反应的温度与时间（三）反应体系中酶与修饰剂的比例一、被修饰酶的性质（一）酶的稳定性 包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以 及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制 剂的性质等。（二）酶活性中心的状况 包括酶分子活性中心的组成，如参与活性 中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的 形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。（三）酶侧链基团

12、的性质与反应性1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂 等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺 酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯 (DNS)和苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反 应、甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。5、吲哚基的化学修饰： 2-羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等 。 6、甲硫氨酸侧链基团的化学修饰： H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等 7、二硫键的化学修饰： 2-巯基乙醇、二

13、硫苏糖醇、过甲酸等。 8、酚基的化学修饰： N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化 试剂、二异丙基氟磷酸。 9、胍基的化学修饰： 丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。二、修饰反应的条件修饰反应应尽量在酶稳定 条件下进行，并尽量不破坏酶 活性必需基团，修饰率高，活 力回收要高（一）pH与离子强度：pH决定了酶分子中反应基团的解 离状态，酶的解离状态不同，其反应 性能也不同；另一方面，有些修饰试 剂在不同pH下，与同一种基团反应可 以形成不同的产物。离子强度对修饰 反应也有重要影响。（二）修饰反应的温度与时间严格控制反应温度和时间可 以减少或消除一些非专一性的修 饰反应。（三）反应体系中酶与

14、修饰剂 的比例酶与修饰试剂的比例可以 控制酶分子的修饰程度。第三节 修饰酶的性质迄今，已有100多种蛋白质（其 中许多是酶）被修饰后在很多领域 中显出许多优良特性。修饰酶的性质改变主要表现为稳定性提高 体内半衰期延长 免疫原性和毒性降低或消除 膜渗透性提高 在体内的生物分布与代谢行为和药用酶的疗效得以改善 在有机溶剂中的溶解度 耐有机溶剂变性的能力提高等 例： 大肠杆菌L-天冬酰胺酶作为治疗 淋巴性白血病、恶性淋巴肿瘤的酶制 剂已在国外应用于临床，并且是治疗 急性淋巴性白血病治疗指数最高的药 物。缺点：由于它来源于微生物，对人而 言是一种外源性蛋白，有较强的免 疫原性，临床上常见进行性免疫反

15、应和全身性过敏反应，而限制了其 临床应用。改进方法利用聚乙二醇修饰后的天冬 酰胺酶不仅可降低或消除酶的抗 原性，而且可以提高酶的抗蛋白 水解的能力，延长酶在体内半衰 期，提高药效。结果美国FDA正式批准的用于治疗急性淋 巴细胞白血病的培门冬酶（Pegaspargase, 商品名为Oncaspar）即为L-天冬酰胺酶的 聚乙二醇螯合物，该产品已于1994年首先 在美国上市。 热稳定性一般来说，经过化学修饰的酶，热 稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基 团与酶分子的多个功能基团相互交联 增加了酶分子构象的稳定性。天然酶和修饰酶的热稳定性比较酶 修饰剂修饰酶 天然酶处理条件 (/时间)

16、残留酶活(%)腺苷脱氢酶胰蛋白酶过氧化氢酶溶菌酶尿激酶糜蛋白酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷人血清白蛋白肝 素37/100min100/30min50/10min100/30min37/48h37/24h70 10046 6440 9020 9980 09550体内半衰期经过化学修饰后很多酶的抗 蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活 因子的能力以及对热稳定性都有 增加和提高，也就相应提高了酶 在生物体内的半衰期，这一点对 提高药用酶的疗效至关重要。 天然酶与修饰酶在生物体内半衰期的比较酶修饰剂半衰期或酶活残留率(%)/时间天然酶修饰酶羧肽酶C 精氨酸酶 -淀粉酶 谷氨酰胺酶-天门 冬酰胺酶 L-天门冬酰胺酶 尿酸酶 -葡萄糖苷酶 超氧化岐化酶 尿激酶 氨基己糖苷酶A 精氨酸酶 酰苷脱氨酶