体内药物分析概述

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1、新浪微博analysisDMPK 2014-12体内药物分析 Biopharmaceutical Analysis; Biomedical Analysis乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：1.支气管感染、肺部感染：一次2片 ，一日2次，或一次1片，一日3次 ，疗程7-14日。2.急性单纯性下尿路感染：一次1片 ，一日2次，疗程57日；复杂性 尿路感染：一次2片，一日2次，或 一次1片，一日3次，疗程1014 日。3.细菌性前列腺炎：一次2片，一日2 次，疗程6周。0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日抗菌药物的抗菌活性药物抑制或者杀灭病原菌的能力最低抑菌浓度（m

2、inimum inhibitory concentration）抑 制培养基内细菌生长的最低浓度。MIC最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration） 杀灭培养基内99.9%的微生物。MBC喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓 度的峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。 浓度依赖性时间依赖性杀菌活性与药物浓度维持在MIC以上时 间的长短有关。-内酰胺类、林可霉素类等抗生素。乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：1.支气管感染、肺部感染： 药物随着血液到各个组织2. 急性单纯性下尿路感染： 药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用3

3、. 细菌性前列腺炎： 药物随着血液到前列腺组织0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日测定血液、尿液甚至组织中的药物浓度1.1体内药物分析的定义体内样品（生物体液、器官或组织）中药物 及其代谢产物或内源性生物活性物质的定 性、定量分析。体内样品确定分析对象药物、代谢产物、内源性生物活性物质 确定待分析物定性、定量分析如何选择分析手段、建 立方法并验证1.概述体内药物分析原料药药纯纯度高 干扰扰少容量分析为主制剂剂主药药一或多 辅辅料干扰扰多仪器分析为主体内药药物成分复杂杂 干扰扰众多 浓浓度很低高灵敏度 高选择性的 方法1.2体内药物分析对象和待测物特点成分复杂、干扰众多生物基质的干扰蛋白

4、质、糖、脂肪、离子其他药物的干扰卡马西平治疗癫痫的有效血药浓 度为38g/ml，潜在中毒浓度为12 g/ml。病人可能之 前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠、乙琥胺等。代谢产物与原型药物互相干扰抗抑郁药米氮平 DMR8-OHMN-O-MRT方法选择选择 性 要高体内药物分析对象和待测物特点采样量小，浓度很低常见的生物样品采样量少，特定条件采集，不易重新获得 血浆：人13ml；犬15ml；大鼠0.30.5ml浓度为ng/mlg/ml 数量级p 血液（血浆、血清、全血）、尿 液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等 均匀生物样品 p 心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀 生物样品方法灵敏度 要高1.3 体内药物分析方

5、法的特点对分析方法的要求高：满足灵敏度及专属性的要求样品需要经过前处理，才能分析分析工作量大，方法验证要求严格，测试数据处理和结果阐明较为复杂1.概述1.4体内药物分析的任务定性分析药物代谢产物、内源性物质是什么定量分析血浆、组织、尿液药物及代谢物浓度药物代谢与动力学（drug metabolism and pharmacokinetics，DMPK）研究新药研发治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring， TDM）临床应用内源性物质检测疾病标志物社会事件中的分析食品安全、法医毒物分 析等1.概述体内药物分析的任务：DMPK药代动力学研究涉 及药物在体内的吸 收、分布

6、、代谢与 排泄等动态过程， 需要研究血药/组织浓度时间曲线的 变化，探讨药物分 布与药理作用的关 系。1,2 Stability + Solubility 3 Passive + Active Trans. 4 Pgp efflux + CYP 3A4 5- Hepatic first pass effect药物代谢与动力学血药浓度-时间曲线尿药累积排泄曲线生物等效性评价绝对生物利用度相对生物利用度代谢途径代谢酶体内药物分析的任务：TDMTDM即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临 床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动 学原理调整给药方案。方向是实现个体化给药，目 的为临床合理用药服

7、务，达到最佳的药物治疗效 果。治疗范围中毒范围无效范围C最大耐受浓度最小有效浓度治疗药物监测血药浓药浓 度 g/ml10202030304040药药理及 毒性反应应有效血药浓药浓 度眼球震颤颤运动动失调调精神异常抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应患者女性，25岁，因癫痫强直阵挛性发作入院，遂静脉注射负荷剂量苯妥 英钠800mg并开始口服维持剂量250mg/d。测得苯妥英钠的浓度为 3.6 g/ml，医生考虑到尚未达到治疗浓度范围，故增加剂量到400mg/d。患 者出现痉挛等类似癫痫发作症状。测得血药浓度为10.9g/ml，医生拟打算再次增加剂量。患者白蛋白为20g/L(正常范围是34

8、48g/L)，于是建议检查患者游离苯妥英 钠浓度。结果显示游离苯妥英钠浓度为4.9 g/ml（游离药物治疗浓度范围 12 g/ml ），判定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为250mg/d。体内药物分析的任务：内源性物质检测体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌 酐、草酸、尿酸等。机体正常生理条件或机体发生病变：测定体内内源 性物质或疾病标志物的含量，疾病的辅助诊断或及 早预防。药物（中药）代谢组学研究体内药物分析的中心任务体内药物分析方法学研究生物样品预处理方法分离分析实验条件的优化选择考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性 范围等为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵 敏、

9、准确、快速、简便的体内药物分析方法。2.1体内样品的种类与采集血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳 汁、脑脊液等均匀生物样品心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品样品选取原则（1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；（2）易于获得；（3）便于处理，适合于分析；（4）根据不同目的与要求进行选取。2.体内样品的种类、采集与贮存体内样品种类与采集血液自然 凝结加抗 凝剂离心离心全血上层：血清serum（比血浆少纤 维蛋白原）（40%）下层：血细胞（凝块）上层：血浆 plasma（50%）下层：血细胞血样Blood一般在给药给药 后的不同时间时间 点采集血样样体内样品种类与采集尿样Uri

10、ne特点：尿药浓度通常变化较大；尿药大多呈结合状 态。优点：易得，且样品量多；正常尿液仅含微量蛋白。缺点：尿液是一种良好的细菌培养基；尿液中多具有 紫外吸收的化合物。 一般在给药给药 后的不同时间时间 段收集尿样样体内样品种类与采集唾液Saliva优点：非伤害性采样，且不受时间地 点限制。缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓；某些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓 （UP）十分接近，但两者相关系数不明确；pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液 中的药物浓度 。一般自然采集或刺激采集，量少体内样品的种类与采集组织tissue指各种体内脏器，需要对其进行均匀化制备，使之成匀浆 溶液反应药物在脏器的分布

11、与蓄积情况头发hair取样方便，可以获得长期的用药史信息前处理复杂，需要排除头发表面的各种干扰2.2 体内样品贮存与处理室温放置时间短期保存温度与时间长期保存温度与时间 -20、-40、-80分装保存便于测定去活性保存防止酶降解保存温度与时间由什么决定？2.体内样品的种类、采集与贮存研究维生素C泡腾片进入人体后血药浓度-时间 曲线变化，通过测定给药后人血浆中维生素C 实现。问：采集血样之后如何保存？维生素C的 性质？维生素C容易氧化，因此采集 血样后加入抗氧剂保存。3.1 体内药物分析的一般流程n血样n尿液n唾液n胆汁n组织器官前处理方法n分离n纯化n浓集样品测定n方法建立n方法优化方法学研究

12、n灵敏度n准确度n精密度n线性和范围n耐用性n 灵敏、准确、快速、简便3.体内药物分析方法的建立与评价新药临床药物代谢动力学评价新药I期临床试验阶段中进行药物在健康志愿者 体内药物代谢动力学，探讨药物在体内吸收、 分布和消除的特点，为II期临床实验的给药方案 制定提供伦理依据。研究内容包括健康受试者单次与多次给药的药 物代谢动力学研究、饮食的影响、代谢产物的 代谢动力学研究、药物-药物的代谢动力学相互 作用研究等。体内药物分析 方法是关键人血浆中普卢利沙星活性代谢产物NM394的检测羧基：酸性 基团哌嗪环：碱性、 水溶性增加共轭结构分析方法建立分析待测物NM394分析目标建立分析方法可以专属、

13、灵敏、准确 的检测出血浆中NM394HPLC法分离分析选择内标化合物准确定量选择前处理方法消除干扰、提高检测浓度分析方法的建立色谱条件及优化体外方法的建立色谱柱：Diamonsil C18 柱 (5 m, 200mm4.6mm i.d.)保护柱： DiamonsilTM ODS 流动相： 乙腈-0.5% 三乙胺（磷酸调pH3.0） 为21:79流速： 1 ml/min荧光检测：ex - 280 nm, em - 425 nm柱温：30 内标化合物为洛美沙星（结构类似、性质相近）分析方法的建立样品前处理分析方法的优化必须考虑 生物样品的前处理的影响3.2体内分析样品前处理3.2.1 生物样品前处

14、理的目的 纯化药物，消除干扰 净化 满足检测灵敏度的要求 富集 减少对分析仪器的污染 改善分析环境除非生物样品基质不会干扰检测，也不会污 染仪器，同时还有较好的灵敏度3.体内药物分析方法的建立与评价示例：血液中酒精的检测（直接测定）顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测0.2ml全血和0.5ml内标放到小瓶后迅速封口小瓶被放到顶空进样器上自动加热获得气液两相平衡将液上气体注入GC分析3.2.2蛋白沉淀 protein precipitation PPT 测定血样时用，去除蛋白质，使结合的药物释放出 来有机溶剂沉淀法（甲醇、乙腈）中性盐析法（饱和硫酸铵）强酸沉淀法（高氯酸）使蛋白变性后除去蛋白沉淀

15、过程示意图ABCDA 血浆样品200lB 加入甲醇600lC 涡旋混合3min后D 10000 rpm离心10min后34沉淀剂每1容积血浆加入沉淀剂容积0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8钨酸盐-硫酸3.399.799.899.9100.0(饱和)硫酸铵21.353.498.3*CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率*：样品浑浊，妨碍准确测定蛋白沉淀应用特点确定沉淀剂与血浆的最佳比例稀释倍数满足检测灵敏度的要求尽可能多沉淀蛋白，减少对仪器的污染适合浓度较高的血样处理过程快速，适合不稳定的药物测定3.2.3液液萃取 liquid-liquid extraction LLE常选择与水不混溶的有机溶剂，根据药物在 水中与有机溶剂中的溶解度不同而将目标药 物和干扰物质分开，随后浓缩含有目标药物 的有机层体液中内源性物质多为极性成分体液中内源性物质多为极性成分药物多为亲脂性弱酸或弱碱药物多为亲脂性弱酸或弱碱液液萃取示意图取1ml血浆 置具塞玻璃离 心管中精密加入5ml 乙酸乙酯 提取溶剂充分涡旋混合 3m