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1、安徽医科大学硕士学位论文EPO对缺血再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及相关蛋白表达的影响姓名：徐礼友申请学位级别：硕士专业：外科学(泌尿外)指导教师：诸禹平20100501安徽医科大学硕士学位论文 6EPO对缺血再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及相关蛋白表 达的影响 中文摘要 中文摘要 目的 随着肾脏移植术、肾血流阻断手术广泛开展以及各种疾病导致休克的发生，肾缺血再灌注损伤（RIRI）是医务工作者必须面对又不能完全解决的问题。近年来人们对RIRI已足够重视，有些机制还不是十分清楚，但肾小管细胞凋亡是关键环节， Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，和它对应的
2、Bax基因有促凋亡作用，它们在KIRI中蛋白表达机制及相互关系现在还处于探索阶段。促红细胞生成素（EPO）已被广泛用于治疗肾性贫血，有国内外学者报道了EPO对KIRI的防治作用。实验用EPO干预IR大鼠，观察EPO对急性缺血再灌注损伤（IRI）大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响，探讨EPO对急性肾脏IRI保护作用的可能机制。 方法 取30只雄性wistar大鼠随机分为3组，假手术对照组，缺血再灌注（IR）组，EPO干预组（IR+T） ，每组10只。0.5%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉各组大鼠后，IR+T组术前20min经腹腔注射EPO(500 U/kg)，IR组和假手术对照组注射等量
3、生理盐水。下腹正中切开IR组和IR+T组大鼠的腹腔，游离出肾脏和肾动脉，用哈巴狗钳夹闭双侧肾动脉，完全阻断双肾血流45min，取下双侧肾动脉上哈巴狗钳，观察肾脏颜色由紫红逐渐变红，缝合腹部切口。假手术组仅打开腹腔游离肾脏及肾动脉45min后缝合。各组大鼠正常饮食。12h后0.5%戊巴比妥钠再次麻醉各组大鼠，打开腹部缝线，穿刺心脏取血并切除左肾制备标本。应用细胞凋亡原位标记法(TUNEL法)、免疫组化技术检测EPO干预后对肾脏细胞凋亡及bax,bcl-2蛋白表达的影响。 结果 IR 组血 BUN，Cr 水平高 IR+T 组（P IR+T 组IR组，差异有统计学意义（P 0.05）（见 Tab 2
4、）。 3.43.4 电镜下肾组织结构的变化 假手术对照组肾小管及肾小球结构未见明显异常（Fig 1A）；IR 组可见部分肾小管上皮细胞有凋亡形态特征改变,即核染色质浓缩致密,出现染色质边集,小管上皮细胞空泡变性（Fig 1B）。IR + T 组肾小管上皮细胞结构损伤程度较 IR 组明显减轻：表现为肾小管上皮细胞大部分结构正常或基本正常,染色质分布较均，无明显空泡形成，肾小球结构无明显异常（Fig 1C）。 Fig 1 肾组织电镜图像200 A：假手术组；B：IR 组；C：IR+T 组 安徽医科大学硕士学位论文 214 讨论 4.14 讨论 4.1 缺血再灌注损伤与临床 人们认识最早且研究最多的
5、是心脏缺血再灌注损伤，现已证实在脑、肾、肝、肺、胃肠道、肢体及皮肤等多种组织器官都存在缺血再灌注损伤的现象。缺血再灌注损伤的原因有以下几点：1.全身循环障碍后恢复血液供应，如休克微血管痉挛解除后、心脏骤停后心肺复苏等。2.组织器官缺血后血流恢复，如器官移植及断肢再植术后。3.某一血管再通后。缺血时间长短、侧支循环情况、器官需氧程度和再灌注条件影响损伤程度。缺血再灌注损伤的机制尚不完全清楚，其可能机制是： 4.1.14.1.1 自由基的损伤作用 以活性氧(reactive oxygen species,ROS)为例，ROS 是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程产生的具有很高生物活性的氧分子，如过氧
6、化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)等，在 IRI 时大量产生。ROS 可来源于线粒体电子传递系统、环氧化酶、脂氧化酶、内质网混合功能氧化酶和黄嘌呤氧化酶系等多条途径3。组织乏氧代谢生成次黄嘌呤堆积，而次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成有毒性的 ROS，大量产生的 ROS 若超过机体的清除能力，耗竭体内还原物质，即可直接损伤组织和诱导细胞凋亡。ROS 在 IRI 中起重要作用，介导整个损伤过程4，其主要损伤机制如下：ROS 可直接与细胞膜不饱和脂肪酸和胆固醇发生脂质过氧化反应，使细胞膜的流动性下降、通透性增高，影响有酶参与的生化过程和离子泵功能。还可通过修饰氨基酸和与肽键反应攻击蛋白质，导致
7、肽链断裂，使蛋白质尤其是酶蛋白丧失活性；也可直接损伤 DNA 分子而导致细胞凋亡。DNA 双链断裂可使包括多聚 ADP 核糖合成酶(poly ADP ribose syntherase，PARS)在内的 DNA 修复系统活化。PARS的功能是将烟酰胺腺苷二磷酸(NAD)上的 ADP 核糖单体转运至核蛋白，其过度活化必然导致 NAD 缺乏，抑制内源性 ATP 的产生，从而加重损伤，称为 PARS 自杀，可能是氧和氮来源的 ROS 的直接细胞毒作用。另外线粒体也是 ROS 损伤的直接靶器安徽医科大学硕士学位论文 22官，ROS 作用于线粒体影响呼吸链能量代谢，加重了细胞损伤和凋亡。 41.241.
8、2 钙超载 细胞内低 Ca2+浓度是维持细胞正常生理功能的前提。IRI 将破坏内皮细胞对Ca2+的自稳调节，使细胞内 Ca2+超载，这是导致细胞损伤的关键。再灌注时，Ca2+与细胞质受体钙调蛋白结合后，激活蛋白酶和磷酸酯酶 A2，引起膜磷脂水解并伴有氧自由基的产生，游离脂肪酸释放，使细胞膜和线粒体膜的结构和骨架破坏，线粒体肿胀导致氧化磷酸化脱偶联，使能量代谢发生障碍。钙离子依赖性蛋白酶的激活，使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤脱氧酶（XO） 。再灌注中大量分子 O2-在 XO催化下，与堆积的次黄嘌呤和黄嘌呤反应，伴随大量氧自由基产生。过量的 Ca2+还可以激活中性粒细胞，引起其“代谢爆发” ，产生大量
9、氧自由基。氧自由基可使脂质发生过氧化反应，直接损伤细胞膜，导致细胞膜通透性增加，促进新的 Ca2+内流，同时氧自由基又可破坏线粒体结构，干扰氧化磷酸化过程，加速 ATP 等高能磷酸化合物的耗竭， 使 ATP 依赖的离子泵活性下降， 其结果也促进了细胞内 Ca2+的增加。钙超载与氧自由基的产生是导致 IRI 的重要因素，二者相互影响、协同作用，而导致 IRI 加重。 413413 白细胞的作用 组织缺血和再灌注时白细胞浸润增加的机制还不十分清楚。可能是由于组织受损时，细胞膜磷脂降解，花生四烯酸代谢产物增多，其中有些物质具有很强的趋化作用，因而就能吸引大量白细胞进入组织或粘附于血管内皮，而白细胞本
10、身又能释放很多具有趋化作用的炎性介质，从而使微循环中白细胞进一步增加。白细胞积聚对组织的损伤作用在于:(1)嵌顿、堵塞毛细血管有助于形成无复流现象。微动脉及微静脉亦有大量白细胞粘附于内皮细胞，虽不一定堵塞血流，但粘附的白细胞仍可损伤组织并释放趋化因子从而吸引更多的细胞。(2)白细胞可以增加血管通透性，水肿组织的含水量与白细胞密度呈正相关，说明白细胞可能引发水肿。白细胞增加血管通透性、引发水肿的机制与白细胞释放的某些炎症介质有关。(3)激活的中性粒细胞释放溶酶体酶，可使组织发生蛋白水解性破坏和液化。(4)中性粒细胞可通过产生氧自由基而损伤组织。 安徽医科大学硕士学位论文 23414414 细胞凋
11、亡 肾脏是高灌注器官,对缺血及再灌注非常敏感。肾缺血缺氧时产生大量自由基、引起钙超载、使白细胞激活，并释放各种血管活性物质，使肾血管收缩,局部循环障碍，再灌注时由于线粒体膜通透性增加，启动了 Caspase 家族蛋白酶，引起序列 DNA 酶效应而进一步加重细胞凋亡和坏死5。缺血再灌注最先出现并损伤最重的是肾小管上皮细胞，肾小管上皮细胞凋亡比细胞坏死更能预见肾功能的损害,缺血可以导致以细胞凋亡为主的细胞死亡。 由于各种疾病、 创伤导致的休克， 肾脏移植术和肾血流阻断手术的广泛开展，肾缺血再灌注损伤是一种常见的病理生理现象，尽管采取各种预防及治疗手段，但肾脏功能仍有不同程度的受损甚至导致罹患者一定
12、的死亡率，缺血再灌注损伤仍是临床上一棘手的课题。 4.2 Bcl-24.2 Bcl-2 家族与细胞凋亡的关系 自从 1972 年 Kerr 提出细胞凋亡的概念至今，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究,但是，凋亡的分子和生化机制迄今尚未彻底明了,而已形成的初步认识大多源于对 Bcl-2 基因家族的研究。已知6，调亡进程可分为三个时相：诱导期，效应期和降解期。在诱导期，细胞接受各种信号从而引发各种不同的效应；进入效应期后，经过一些决定细胞命运（存活/死亡）的分子调控点，细胞进入不可逆的程序化死亡，这些调控分子包括一系列原癌基因和抑制癌基因的产生，其中 Bcl-2 家族起着决定性的作用；降解期
13、则产生可见的凋亡现象。 Bcl-2 基因（即 B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。目前已经发现的Bcl-2 蛋白家族按功能可分为两类7，一类是象 Bcl-2 一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的 Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫 Ced-9、牛痘病毒 E1B119kD 等；而另一类具有促进凋亡作用，如 Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid。 安徽医科大学硕士学位论文 24抗凋亡成员 Bcl-2 和 Bcl-xl 主要定位于线粒体外膜、内质网膜和核膜等。但在细胞接受凋亡刺激后, 抗
14、凋亡成员可受到磷酸化和蛋白质水解等修饰的调节。Bcl-2 和 Bcl-xl 均可被蛋白激酶磷酸化或经死亡酶(caspase , CASP) 的催化裂解。 一种看法是这类修饰可能是 Bcl-2 和 Bcl-xl 发挥抗凋亡功能所必需, Bcl-2 和 Bcl-xl 定位于内质网膜和核膜, 可能与某些非线粒体依赖的细胞凋亡或是仅与其他细胞功能有关。 此外, 还发现少部分 Bcl-2 和 Bcl-xl 分布于细胞浆中, 其功能及其在细胞凋亡中的去向, 还不清楚。 促凋亡成员 促凋亡成员与抗凋亡成员相反, 有损伤线粒体的作用。绝大部分促凋亡成员分布于细胞浆中。Bax 是最早发现的促凋亡成员, 有关其细
15、胞内定位的研究也最多。 Bax 分子结构中含有类似于抗凋亡成员的疏水 C 端, 然而亚细胞分级和免疫组织化学实验均表明 Bax 在正常细胞中主要定位于细胞浆。虽然在线粒体上也发现有部分 Bax 存在, 但 Bax 分子并非插入线粒体外膜内而是松散地附着于线粒体表面8。对于促凋亡成员中的蛋白质亚族, 如 Bad、Bid 和 Bim 等均主要存在于细胞浆中。Bak 是迄今发现的仅有的一个定位于线粒体的促凋亡蛋白质成员。但是, Bak 在正常细胞中并不表现促凋亡活性, 推测可能是在线粒体外膜中的 Bak 与 Bcl-xl 结合而被抑制的结果。 细胞受到凋亡刺激后, Bak 分子 N 端暴露并发生构象
16、变化, Bak 得以与 Bcl-xl 分离，释放出来的 Bak 仍继续留在线粒体外膜内, 并与裂解激活的 Bid 结合, 结果导致 Bak 激活或 Bak 寡聚化并形成Cytc 的输出通道, 从而引起细胞凋亡。 有研究发现9，bcl-2 蛋白不但可以直接抑制细胞凋亡，促凋亡 bax 蛋白的细胞毒作用。bcl-2 常和 bax 结合成异源二聚体。bax/bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素10-11，比例减小凋亡抑制作用增强，反之则减弱。 4.34.3 EPOEPO 在细胞凋亡中防治作用 EPO 是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，是一种含唾液酸的酸性蛋白。人类安徽医科大学硕士学位论文 25EPO 基因位于 7 号染色体长臂 22 区，相对分子量为 34，000，有 4 个糖基化位点。EPO 不仅在肾脏和肝脏中分泌，而且在脑、卵巢、输卵管、子宫和睾丸都有 EPO的分泌，而 EPO 受体在骨髓的红细胞的前体细胞（erythroid precursors） 、巨核细胞（megakar
