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1、安徽医科大学硕士学位论文多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞凋亡的研究姓名：李慧蓉申请学位级别：硕士专业：指导教师：魏兆莲安徽医科大学硕士学位论文 4 多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞凋亡的研究 研究生： 李慧蓉 导 师： 魏兆莲 副教授 安徽医科大学第一附属医院生殖中心，合肥 230032 中文摘要中文摘要 多囊卵巢综合征( PCOS) 是一种以内分泌紊乱为主、 多种代谢异常导致的异质性临床综合征。 PCOS患者双侧卵巢有大量窦卵泡存在,但是不能周期性产生成熟卵泡,其病理机制尚不清楚。目前认为原发性、内在性卵泡生长异常可能是引起PCOS不排卵及临床内分泌改变的病理基础。研究表明，内在性的卵泡发育异常
2、可能与卵巢颗粒细胞的凋亡调控失常有关。内质网应激(ERS) 启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。通过激活未折叠蛋白反应(UPR) 以保护由ERS所引起的细胞损伤, 恢复细胞功能, 但是如果损伤太过严重, 内环境稳定不能及时恢复, ERS则引起细胞凋亡。DNA受到损害的卵巢颗粒细胞存在内质网应激标志性蛋白CHOP表达。在上述研究的基础上，本文探讨了多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞凋亡与PCOS的发病可能的相关关系。 目的目的： 旨在研究多囊卵巢综合征患者卵巢组织切片各级卵泡数和其颗粒细胞的凋亡情况，以及凋亡调控蛋白 Bcl2、Caspase3 和内质网应激蛋白 Bip、CHOP 蛋白的表
3、达。 方法方法： 选择因多囊卵巢综合征行卵巢楔形切除的卵巢病理组织 21 例，同时选择年龄相匹配并于卵泡期手术的非多囊卵巢综合征正常卵巢组织 15 例为对照组。(1) HE安徽医科大学硕士学位论文 5 染色，采用双盲读片，比较两组中各级卵泡的数目；(2) 3末端原位标记法（TUNEL）检测各级卵泡颗粒细胞的凋亡情况，比较两组凋亡率差异；(3) 免疫组化法检测凋亡调控蛋白 Bcl2、Caspase3 和内质网应激蛋白 Bip、CHOP 蛋白在各级卵泡颗粒细胞表达情况，比较两组间的差异。 结果：结果： 1PCOS 组患者卵巢生长卵泡数增加PCOS 组患者卵巢生长卵泡数增加 光镜下病理学观察：由两位
4、病理科主治医师采取双盲法在光镜下观察其病理结构，随机挑选 10 个视野（1010） ，记录各级卵泡的数量。两组卵巢组织切片始基卵泡、闭锁卵泡比较，差异均无统计学意义；PCOS 组过渡型初级卵泡、典型初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡较对照组增多，差异有统计学意义（P 10mL,(卵巢体积=05 长cm 宽cm 厚cm)。此外还需排除外高雄激素血症的其它原因(先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、雄激素分泌性肿瘤、21-羟化酶缺乏性非典型肾上腺皮质增生、外源性雄激素应用等)。选择15例2001年至2009年在安徽医科大学第一附属医院因非PCOS因素(包括子宫肌瘤,子宫内膜癌 ,宫颈癌) ，于卵泡期行妇科手术
5、的生育年龄妇女并经过组织病理学检查证实无明显形态异常的正常卵巢组织皮质的存档石蜡标本。选择标准:年龄35岁；月经周期正常(2535) d 。两组患者术前至少3 个月内未用过性激素和促排卵药物。所有标本的获取经临床伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。 2.2 主要试剂 多聚赖氨酸：北京中杉公司； 无水乙醇：无锡市亚盛化工有限公司； 二甲苯：上海化学试剂有限公司； 枸橼酸钠：广东汕头市西陇化工厂； TUNEL 试剂盒：瑞士 Roche 公司； 蛋白酶 K：美国 sigma 公司； DAB 显色试剂盒：北京中杉金桥公司； 安徽医科大学硕士学位论文 15 苏木素：国药集团化学试剂有限公司； 伊红：国
6、药集团化学试剂有限公司； 中性树胶：国药集团化学试剂有限公司； 1PBS 磷酸缓冲液：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4溶于双蒸去离子水中，定容至 1L； 鼠抗 Bcl-2 单克隆抗体， ；购自北京中杉公司； 兔抗 Caspase 3 多克隆抗体，购自 abcam 公司； 鼠抗 CHOP 单克隆抗体，购自 Santa Cruz 公司； 兔抗 BiP 多克隆抗体，购自 abcam 公司； 免疫组化染色试剂盒（链霉卵白素-过氧化物酶试剂盒通用型） ，购自北京中杉公司。 2.3 实验仪器 2000R 滑动平推片切片机（Lecia） BL-2
7、200H 型电子分析天平（日本岛津） ； PHS-25 型精密 pH 计（上海今迈仪器仪表） ； DHG-9101-2S 型电热干燥箱（扬州鸿都电子有限公司） ； SW-CJ-2D 型医学净化工作台（苏州净化设备有限公司） ； 78-1 加热磁力搅拌器 （江苏省金坛市实验仪器厂） TD5A-WS 型台式低速离心机（湖南赛特湘仪） 37XC 型倒置相衬显微镜（上海光学仪器进出口有限公司） ； IX-71 倒置显微镜（日本 OLYMPUS 公司） ； 4医用恒温冰箱（中科美菱） ； -80低温冰箱（日本 SANYO 公司） ； TS-A 型水平摇床（金坛国胜实验仪器厂） ； WP700P21 微波
8、炉（格兰仕公司） ； 湿盒由安徽医科大学第一附属医院中心实验室提供。 安徽医科大学硕士学位论文 16 3. 方法 3.1 切片制作 3.1.1 载玻片的处理 载玻片硫酸浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水洗涤置 60温箱内烘干备用，为避免实验过程中组织切片脱落，故于贴片前在载玻片上涂黏附剂多聚赖氨酸，晾干备用。 3.1.2 切片 将蜡块与切片机上修整， 每块切 4m 厚度切片 10 张， 平摊于 40水浴锅，切片展开晾好将其捞出贴于载玻片上； 置 60烘箱内烤 6 小时减少脱片， 备用。 3.2.卵巢组织形态学观察 3.2.1 HE 染色 石蜡标本连续切片制成 4m 厚的切片。从每个标本中随机挑选一张切
9、片行HE 染色。HE 染色步骤如下： (1) 60烘箱内烤片约 4 h； (2) 切片常规脱蜡至水，PBS 洗 5 min； (3) 苏木精染色 5 min； (4) 水洗玻片上多余染液，0.5%1%盐酸酒精分色片刻，约 4 s； (5) 流水冲洗 1530 min； (6) 蒸馏水短洗； (7) 0.1%0.5%伊红染色 5 min； (8) 各级酒精脱水，二甲苯透明； (9) 中性树胶封片； (10) 显微镜下观察，摄像； 安徽医科大学硕士学位论文 17 3.1.2 卵巢各级卵泡计数 切片行 HE 染色后，分别由两位病理科主治医师采取双盲法在光镜下观察其病理结构，随机挑选 10 个视野（1
10、010） ，记录各级卵泡的数量。 3.2 卵巢组织颗粒细胞的凋亡测定 3.2.1 TUNEL 法测定卵巢组织颗粒细胞的凋亡 TUNEL 试剂盒购自瑞士 Roche 公司，操作按照试剂盒说明书进行。步骤如下： (1) 捞片后置烤箱 60 20 min 以使切片紧密粘附。做免疫组织化学之前，再放入 60烘箱内烤片约 4 h； (2)卵巢石蜡切片常规脱蜡至水； (3) 0.01mol/ L PBS 洗 5 min3 次； (4) 10g/ ml 蛋白酶 K 处理, 室温 15min； (5)滴加末端转移酶缓冲液 TUNEL 于切片上, 加盖盖玻片，37 ，1h； (6) PBS 洗 5 min3 次
11、； (7)滴加 ConventerPOD 于切片上, 37,30min； (8) PBS 洗 5 min3 次； (9)DAB 显色, 镜下控制； (10) PBS 洗 5 min3 次； (11) 苏木素轻度复染，约 2 min，用自来水缓慢冲 30 min，蓝化；脱水，中性树胶封片，显微镜下观察，摄像。 (12)以 PBS 代替末端转移酶缓冲液 TUNEL 作阴性对照。 3.3.2 观察卵泡颗粒细胞凋亡阳性细胞 高倍视野下(400) , 每张切片随机取10 个视野, 观察卵泡中凋亡颗粒细胞占颗粒细胞总数的百分比值, 即凋亡指数 AI。 3.3 卵巢组织 Bcl2、Caspase3、Bip
12、和 CHOP 蛋白表达的测定 安徽医科大学硕士学位论文 18 3.3.1 免疫组织化学 具体操作步骤： (1) 载玻片用多聚赖氨酸涂片后晾干。捞片后置烤箱 60 20 min 以使切片紧密粘附。做免疫组织化学之前，再放入 60烘箱内烤片约 4 h； (2) 切片常规脱腊至水； (3) 切片放入湿盒，滴加 3%H2O2，室温孵育 10min，PBS 洗 5 min3 次； (4) 微波修复：将玻片放入装有 0.05 M 枸橼酸钠缓冲液的玻璃缸内，在微波炉内加热沸腾。冷却后，PBS 洗 5 min3 次； (5) 切片取出，周围水分用滤纸吸干，放入湿盒，用 5%正常羊血清,37封闭 1 h。甩去多
13、余液体，不洗； (6) 切片上滴加适当稀释度的一抗（PBS 配制）Bcl-2：1：100，Caspase3：1：150，BiP：1：50，CHOP：1：100，37孵育 1 h，再放入湿盒 4冰箱过夜； (7) 第二天拿出，PBS 洗 5 min3 次； (8) 滴加生物素化二抗工作液，片子放入湿盒 37孵育 1 h； (9) PBS 洗 10 min3 次； (10) 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温 15min，PBS 洗 5 min3 次； (11) 按说明书配制 DAB 显色剂，在切片上滴加 DAB 显色液，镜下控制染色时间530 min，ddH2O 快速中止反应； (12) PB
14、S 洗 5 min3 次； (13) 苏木素轻度复染，约 2 min，用自来水缓慢冲 30 min，蓝化； (14) 脱水，透明，中性树胶封片； (15) 显微镜下观察，摄像。 3.3.2 观察免疫组织化学阳性 Bcl2、Caspase3、Bip表达均定位于颗粒细胞的胞浆和胞膜,呈棕黄色,胞核无表达为阳性；CHOP表达均定位于颗粒细胞的胞核，以胞核呈棕黄色颗粒为阳性。由两位病理科主治医师在400倍光镜视野下，每张切片观察10个高倍视野，根据阳安徽医科大学硕士学位论文 19 性细胞比例及着色深浅记分：细胞无着色或无阳性细胞为0分，细胞染色浅棕色或阳性细胞占125为1分，细胞染色棕褐色或阳性细胞占
15、2650为2分，细胞染色深棕色或阳性细胞50为3分；根据记分结果分为4个等级，01分为（） ，2分为（） ，34分为（） ，56分为（） 。 3.4 统计学处理 各计量资料数据均采用 X s来表示，各级卵泡的数量、TUNEL染色结果比较，方差齐性资料采用成组设计的t 检验。免疫组化的染色结果，方差不齐资料采用秩和检验。P0.05设为有统计学意义。 安徽医科大学硕士学位论文 20 4. 结果 4.1两组妇女临床指标的比较 PCOS 组 21 例患者，16 例患者月经稀发或过少，5 例患者闭经，13 例患者伴有多毛；对照组 15 例患者，12 例宫颈癌，2 例子宫内膜癌，1 例子宫肌瘤。PCOS患
16、者的平均年龄为（29.631.85）岁，月经周期 60 d 至闭经；对照组平均年龄（30.333.70）岁，平均月经周期（29.34.5）d。两组间年龄、空腹血糖差异无统计学意义（P0.05） ；体重指数（BMI）比较，PCOS 组体重指数（27.144.98）较对照组（22.472.85）高，差异有显著统计学意义（P0.01） 。 4.2 比较两组中各级卵泡的数目 根据卵母细胞形态和组织学特征、颗粒细胞数量、形态和层数，将卵泡分为：(1)始基卵泡： 在初级卵母细胞周围有一层扁平的上皮细胞， 外面有基底膜 （图 2A） ；(2)过渡型初级卵泡：部分单层上皮细胞变为立方形的颗粒细胞, 其中含有初级卵母细胞（图 2B）；(3)典型初级卵泡：全部单层上皮细胞变为立方形的颗粒细胞（图2C）；(4)次级卵泡：颗粒细胞增生达 28 层，无窦腔形成（图 2D）；(5)窦状卵泡：颗粒细胞间产生液体, 堆积形成腔, 卵泡腔将颗粒细胞分为包
