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1、浙江大学硕士学位论文不同年龄人群内皮祖细胞数量与增殖、迁移、黏附、分泌功能 的研究姓名：章浩申请学位级别：硕士专业：心血管内科指导教师：陈君柱20070401浙江人学_ 豌J ：学位论文中文摘要研究目的：观察不同年龄人群血液中分离获得的内皮祖细胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l lE P C s ) 的形态，探索内皮祖细胞在数量及功能上的区别，了解年龄对细胞的影响，为临床应用细胞及分子水平的治疗提供理论基础。方法：选择健康新生儿的脐静脉血和健康成年中青年、老年人的外周血各2 0 例，密度梯度离心法从血液中分离获取单个核细胞，接种在人
2、纤维连接蛋白( h - F B N )包被的培养板，培养4 天后更换培养液，继续培养3 天后收集贴壁细胞进行分析。激光共聚焦显微镜鉴定F I T C U E A - I 和D i I - a c L D L 双染色阳性细胞为正在分化的E P C s ，流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定E P C s ，倒置荧光显微镜下计数。采用M T T 比色法和改良的B o y d e n 小室和黏附能力测定实验观察E P C s 的增殖、迁移、黏附能力。用E L I S A 法测定细胞培养上清液的细胞趋化因子基质细胞衍生因子- 1 ( S D F - 1 ) 的浓度，测定其分泌功能。结果：脐血、中青年及老
3、年人外周血中E P C s 的数量分别为( 2 0 3 0 + 2 0 7 ) 、( 6 2 5 1 0 6 ) 、( 4 4 6 4 - 9 1 ) E P C s 视野( 2 0 0 ) ，比较发现脐血的E P C s 数量比中青年及老年人明显增多( 组间比较P O 0 5 ) 。脐血、中青年及老年人外周血E P C s 分泌S D F I 的浓度分别为( 2 5 8 6 5 4 - 3 0 5 1 ) 、( 1 3 1 9 4 2 0 4 3 ) 、( 1 2 5 5 8 4 - 1 8 5 0 ) P g m l ，脐血的分泌能力明显增强( 组间比较P 0 0 5 ) 。注：新生儿母亲
4、年龄为2 5 3 - - + 3 7 岁，新生儿体重为3 0 5 0 2 1 0 1 2 9 ，出生评分均为1 0 分与中青年组相比，P O 0 0 1 ；与老年组相比，P O 0 0 1 ；与老年组相比，P O 0 53 内皮祖细胞的分泌功能：脐血、中青年及老年人外周血E P C s 分泌S D F - I 的浓度分别为( 2 5 8 6 5 4 - 3 0 5 1 ) 、( 1 3 1 9 4 4 - 2 0 4 3 ) 、( 1 2 5 5 8 1 8 5 0 ) p g m 1 ，比较发现脐血的分泌能力明显增强( 组问比较P O 0 0 1 ) ，中青年的分泌能力亦强于老年人( P O
5、 0 5 ) 。浙江大学硬t 学位论文讨论本实验采用a c L D L D i l 和F I T C - U E A - 1 双染色法鉴定E P C s ，这是国内外最常用的E P C 鉴定方法。a c L D L D i I 和F I T C U E A 一1 双染阳性能够很好地排除非内皮系细胞假阳性，但存在的问题是这一方法并不能区分内皮祖细胞和成熟的内皮细胞。所以我们选取经体外培养的贴壁细胞进行染色，提高内皮祖细胞的分检率。在外周血循环中，多数较成熟的E P C 逐渐丢失C D l 3 3 ，但C D 3 4 及V E G F R 2 表达依然阳性。因此，C D l 3 3 的丢失可能反映
6、了循环E P C 向成熟内皮样细胞的转化，但在什么时间点E P C 开始丢失C D l 3 3 ，目前还不清楚，仍需进一步研究。E P C s 在血管新生和维持内皮功能完整中具有重要作用，新生血管中有2 5 的内皮细胞来源于E P C 。本实验中我们人群按照不同年龄分成新生儿组，6 0 岁以下成年人组和6 0 岁以上老年人组，对循环血液中的单个核细胞进行体外培养，发现在其他条件相同的情况下，随着年龄的增长，E P C 数量减少并且迁移、黏附、功能明显减退，提示年龄因素对E P C 数量及功能显著影响。R a u s c h e r 等“”发现高龄的A p o E 一一小鼠骨髓血管祖细胞数量相对
7、年轻的A p o E - - d 、鼠明显减少。H e i s s 等“”将无主要心血管事件的患者按年龄分成高龄组和年轻组，以硝酸甘油使用前后的血管内径比值作为反映血管内皮功能的指标。结果发现高龄组使用硝酸甘油前后血管内径比值明显低于年轻组，显示高龄组血管内皮功能相对年轻组减退，血管功能障碍。同时分离患者外周血内皮祖细胞，发现高龄组C D 3 4 及C D l 3 3 双阳性细胞其存活率及迁移、黏附、增殖功能均低于年轻组。提示年龄因素对内皮祖细胞功能有显著影响，随着年龄的增长，内皮祖细胞功能受损，最终导致血管内膜功能障碍。S D F l 又名C X C L l 2 或前B 细胞刺激因予，编码两
8、种蛋白：S D F - 1a 和S D F l1 3 。S D F - 1a 主要在骨髓基质细胞及骨髓内皮细胞表达；S D F lB 唯一的受体是C X C R 4 。在C D 3 4 造血干祖细胞表面及E P C s 表面高度表达“”。研究发现，缺血组织的s D F - 1表达的上调能介导干祖细胞归巢到缺血组织参与新生血管的形成。不同浓度的S D F - 1 刺激E P C s ，能明显提高贴壁E P C s 数量，即增加E P C s 的秸附能力；M T T 比色法发现，S D F l 能明显增强E P C s 的增殖能力。S D F 一1 对E P C s 粘附能力影响的强度与浓度有关，
9、S D F 一1 浓度越高，改善E P C s 增殖能力的作用越强。Y a m a g u c h i 等“8 1 用体外扩增的人外周血E P C s 做S D F 一1 诱导的迁移实验，发现S D F - 1 对人E P C s 有强大的趋化1 4浙江大学硕士学位论文活性，这种趋化活性呈浓度依赖性。说明S D F 一1 能有效提高E P C s 数量；改善其E P C s粘附、增殖能力，诱导E P C s 迁移。综上所述，年龄及S D F 一1 浓度均会对内皮祖细胞的数量及功能产生影响，在新生儿的脐血中，具有更高的S D F - 1 浓度，从而脐血具有更多的数量及更高的增殖、迁移、黏附能力，
10、而随着年龄的增长，S D F l 的浓度降低，内皮祖细胞的功能减弱，从而为新的细胞来源及新的制剂研发提供了更多的理论支持。浙江大学硕十学位论文结论经培养的细胞具备内皮细胞家族的特性：摄取D i I - A c L D L ，摄取F I T C U E A I ：细胞表面标志C D 3 4 、A C l 3 3 、V E G F - 2 呈阳性，故我们可认定这些来源于人脐带及外周血的单个核细胞经培养分化，具有3 “ E P C 的特性，且经贴壁后的细胞超过9 5 为E P C s 。脐血分离得到的E P C s 约为中青年外周血的3 倍，随着年龄的增长，血液中含有的E P C s 数量减少，其增
11、殖、迁移、黏附功能下降，同时细胞分泌基质衍生因子( S D F - I ) 的能力亦下降。1 6浙江大学硕f ：学位论文参考文献：【1 A s a h a r aT ，M u r o h a r aT ，S u l l i v a nA ，e ta 1 I s o l a t i o no fp u t a t i v ep r o g e n i t o re n d o t h e l i a lc e l l sf o ra n g i o g e n e s i s S c i e n c e , 19 9 7 ，2 7 5 ( 5 3 0 2 ) ：9 6 4 - 9 6 7 ， 2
12、 M a t t h e wJ C a l l a g h a n , D a n i e lJ e ta 1 H y p e r g l y c e m i a - i n d u c e dr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n di m p a i r e de n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l lf u n c t i o n A n t i o x i dR e d o xs i g n a l ，2 0 0 5 ，7 ( 11 - 1 2 ) ：1 4 7 6 1 4 8 2 【3
13、】P e i c h e vM ，N a i y e rA J ，P e r e i mD ，c ta 1 E x p r e s s i o no fV E G F R - 2a n dA C l 3 3b yc i r c u l a t i n gh u m a nC D 3 4 ( + ) c e l l si d e n t i f i e sap o p u l a t i o no ff u n c t i o n a le n d o t h e l i a lp r e c u r s o r s B l o o d ，2 0 0 0 ，9 5 ：9 5 2 9 5 8 【4
14、 】H i l lJ M ，Z a l o sG ，H a l c o xJ P ，e ta i C i r c u l a t i n gE n d o t h e l i a lP r o g e n i t o rC e l l s v a s c u l a rf u n c t i o n , a n dc a r d i o v a s c u l a rr i s k NE n g lJM e d ，2 0 0 3 ，3 4 8 ：5 9 3 6 0 0 【5 M c G r a t hK E ，K o n i s k iA D ，M a h b yK M ，e ta 1 E m
15、 b r y o n i cE x p r e s s i o na n dF u n c t i o no f t h eC h e m o k i n eS D F - Ia n dI t sR e c e p t o rC X C R 4 D e vB i o l ，1 9 9 9 ，2 1 3 ( 2 ) ：4 4 2 - 4 5 6 【6 L o s o r d oD W ，D i m m e l e rS T h e r a p e u t i ca n g i o g e n e s i sa n dv a s c u l o g e n e s i sf o ri s e h
16、e m i cd i s e a s eP a r tI ：a n g i o g e n i ee y t o k i n e s C i r c u l a t i o n ，2 0 0 4 ，1 0 9 ：2 4 8 7 - 2 4 9 1 【7 U r b i c hC ，D i m m e l e rS E n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s ：c h a r a c t e r i z a t i o na n dr o l ei nv a s c u l a rb i o l o g y C i r eR e s ，2 0 0 4 ，9 5 ：3 4 3 3 5 3 【8 H r i s t o vM ，E dW ，W e b e rP C E n d o t h e l i a lp r
