《哺乳动物基因工程xin》由会员分享，可在线阅读，更多相关《哺乳动物基因工程xin（126页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十六章 哺乳动物基因工程第一节 高等哺乳动物基因工程的基本概念1.概念：动物基因工程是利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。遗传学动物基因工程：外源基因能够通 过配子进行垂直传递并稳定的遗传。非遗传性动物基因工程：转基因仅在当 代表现，不能够遗传给子代。高等哺乳动物的基因工程高等哺乳动物转基因技术高等哺乳动物细胞基因表达技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白质多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型第二节 转基因的动物受体细胞一、高等哺乳动物细胞的生长特性1.正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表
2、面才能生长分裂。血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长。接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制。形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构。上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。1.二、高等哺乳动物受体细胞的条 件1.以高效表达外源基因的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件：细胞系特征：丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养。遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存。合适的标记：
3、便于转化株的筛选和保持。生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。1.三、高等哺乳动物受体细胞的遗传标 记1.营养缺陷型哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）：不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基（HAT培养基）上生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）：不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基（HAT培养基）上生长，载体上的标记基因hprt能与之遗传互补。2.哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记 ：3.常用的
4、高等哺乳动物受体细胞目前，用于医疗用品大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要是：中国仓鼠卵巢细胞。遗传背景清楚，生理代谢稳定。与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确。基因转移和载体表达系统完善。耐受剪切力，便于大规模培养。被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞。其优势如下：第三节 转基因导入动物体内的方法一、动物细胞物理转化法优点：转基因不含任何病毒基因组片段，对于基因治疗尤为安全。缺点：转基因进入细胞后往往多拷贝随机整合在染色体上，导致受体细胞基因灭活或转基因不表达。1.磷酸钙共沉淀法细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力。将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐，生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养
5、液中。由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉淀物进入细胞，DNA释出后先进入细胞质、再进入细胞核，整合到受体细胞的染色体上。磷酸钙转染的基本步骤：DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量；共沉淀物与细胞接触的保温时间；甘油或DMSO等促进因子作用的持续时间等。 影响磷酸钙转染效率的因素：培养皿号 (10 cm) pXGH5(u g)pUC13(u g)细细胞与沉 淀物的保 温时间时间 (h)甘油刺激 时间时间 (min)1556- 25156- 35356- 45516- 551516- 653516- 75563 851563 953563 1055163 11515163 12535163磷酸钙
6、转染的最适条件2.电击转化法（electroporation）将受体细胞悬浮于含有待转化DNA的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小的空洞并增加其通透性，此时外源DNA片段便能不经胞饮作用直接进入细胞质。脉冲的最大电压脉冲持续的时间影响因素：与DNA浓度则无多大关系。3.脂质体包埋法脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡(lipid vesicles)，外周是脂双层，内部是水腔。用它作载体可以把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。将适宜的脂质悬浮在液体介质中，然后迅速地振荡，使之形成大小相当一致的脂质体；用小型的注射针头，将脂质注射到酒精水溶液中，并
7、快速混匀。脂质体的制备的两种方法：脂质转染法：以脂质体为媒介的外源DNA导入受体的方法，叫做脂质转染法。第一种脂质转染法：将外源DNA与阳离子型的脂质体混合形成DNA-脂质复合物。这种复合物可有效地被受体细胞捕获，实现基因的高频率转移，故这种方法又叫做DNA-脂质复合物转染法。在这个过程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起的。第二种脂质体转染法又称脂质体载体法：它是将外源DNA包装在脂质体的内部，然后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源DNA进入细胞质，尔后再进入细胞核，实现基因的表达。制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜消毒灭菌，
8、用它包装的DNA在4下可长期保存不失活性，脂质体载体法的优越性：4.DNA显微注射法应用玻璃显微注射器，可以把重组DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。真正的显微注射(true microinjection)法，DNA是由注射针直接注入细胞。“穿刺”(pricking)导入法，DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。1.二、动物病毒转染 法通过病毒感染的方式将外源基因导入动物细胞内的转基因方法。具有定向性好，实验重复性佳，导入效率高等优点。缺点是载体宿主范围有限。1.动物病毒的特点：具有能够被真核细胞识别的有效的启动子；在感染周期中
9、能够持续地复制使基因达到相当高浓度，并实现有效地表达；病毒具有能够控制自身复制的顺式元件和反式作用因子，改造后可发展成为能够在细胞内长时间地保持高拷贝的外源基因的复制型质粒载体；能高效稳定地整合到染色体，可提高外源基因导入寄主细胞染色体的效率；病毒外壳蛋白能够识别细胞接受器，能够将外源蛋白高效地导入宿主细胞（假病毒粒子法）。2.腺病毒（Adenoviruses ）一群无囊膜的20面体的病毒，其双链DNA的分子大小约为36kb。腺病毒可插入较大的外源DNA片段，而且还可以在寄主细胞中大量地增殖。其次，能最大限度地合成病毒编码的蛋白质。带有反向的末端重复序列，而且在每一条单链的5-末端还共价地连接
10、着一种蛋白质分子。当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多聚体。腺病毒的一般生物学特性其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区（ITR），ITR内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元（E1、E2、E3、E4）承担调节功能，以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。 腺病毒载体的构建策略有三种在细胞内同源重组产生重组腺病毒，首先要纯化出全长的腺病毒DNA，外源基因插入到带有腺病毒基因片段的穿梭质粒中，将腺病毒DNA和重组质粒共转染表达E1基因产物的HEK293细胞中，通过噬斑筛选出重组病毒。 将腺病毒全长DNA序列克隆入Cosmid质粒中，转化大
11、肠杆菌感受菌，在细菌中复制腺病毒DNA序列，然后将外源基因片段插入带适当抗性基因的真核表达质粒，将重组真核质粒线性化后，转化带Cosmid质粒的大肠杆菌，在高表达Cre重组酶的大肠杆菌发生同源重组，将外源基因表达盒插入腺病毒DNA中，用这种方法也可以缺失任何区段的腺病毒DNA。将稀有的限制性内切酶位点引入穿梭质粒和腺病毒骨架载体中，将外源基因克隆入穿梭质粒中，再通过酶切连接的方法将外源基因克隆入腺病毒骨架载体，转化大肠杆菌复制重组质粒，转染相应的包装细胞系后，即可产生复制缺陷型的重组腺病毒。腺病毒DNA载体的特点：基因重排低：外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期。安全性能好：不整合人的
12、染色体DNA，不会导致恶性肿瘤。宿主范围广：对受体细胞是否处于分裂期要求不严格。使用效果好：外源基因在载体上容易高效表达。3.猴肿瘤病毒（SV40）蛋白质质 合成时间时间功能T抗原 早期启动DNA复制 t抗原早期 未知 VP1 晚期主要的病毒外壳蛋白 VP2 晚期次要的病毒外壳蛋白 VP3 晚期次要的病毒外壳蛋白SV40病毒编码的蛋白质在SV40病毒基因组中存在着一个增强子序列。其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组DNA复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。SV40病毒的增强子序列野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，
13、超过其基因组大小(5.2kb)的重组DNA就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。而且，SV40还存在着寄主细胞的局限性，它只能在受纳细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。因此，野生型的SV40病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有用载体。以SV40为基础的基因克隆载体，主要有两种不同的类型： 取代型的重组病毒载体：外源DNA是直接插入在缺陷性的病毒基因组上。由于插入的外源DNA片段，在大小上同被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充这段被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的
14、辅助病毒。利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序： 重组的病毒-质粒载体：在这类载体中，病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖。不过这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒，不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的DNA分子载体。SV40 DNA载体的特点：基因表达好：外源基因能高效表达；基因重排高：病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象；宿主范围窄：只能转染猴细胞；装载量较小。4.反转录病毒载体在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因都能够在正常的细胞中转录。反转录病毒的寄主范围相当广泛，包
15、括无脊椎动物和脊椎动物。反转录病毒具有许多优点，便于发展作为 动物基因克隆载体。反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。反转录病毒的一般生物学特性 反转录病毒载体的主要类型 辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体此种带外源选择标记基因的重组病毒基因组有缺陷，不能合成自身蛋白质，故包装所需的全部蛋白质需靠辅助病毒提供。 不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体当用缺陷性的重组的反转录病毒质粒载体，例如pMLV-gpt DNA传染2包
16、装细胞株时，它便会整合到寄主染色体DNA上进行转录，合成出具有psi序列的反转录病毒载体RNA。1.三、工程胚胎干细胞法1.胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。胚胎干细胞介导法：是将外源基因直接导人ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体ES细胞。在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。第四节 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白1哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理某些氨基酸在代谢过程中能生成含一个碳原子的基团，经过转移参与生物合成过程。体内的一碳单位有：甲基(CH3，methyl)、甲烯基(CH2，methyle
