《微囊化异种嗅球组织移植对脊髓损伤大鼠细胞凋亡及功能恢复的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微囊化异种嗅球组织移植对脊髓损伤大鼠细胞凋亡及功能恢复的影响（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、和中枢神经甚至可通过损伤区和胶质瘢痕区。1 。在嗅球内，它是唯一接触和包被嗅神经轴突的胶质细胞。在整个C N S 通路中，它包被嗅神经轴突，以防止它们与其它C N S 细胞接触。O E C s 作为一种特殊类型的胶质细胞，其生物学作用极其广泛，不但能支持和促进神经系统神经元的生长、+ 存活，同时还可以分泌许多对神经元有促进作用的营养因子，如神经生长因子( N G F ) 、脑源性营养因子( b r a i n - d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ，B D N F ) 、神经营养因子一3( N F 一3 ) 、神经营养因子- 4 (
2、 N F - 4 ) 、细胞外基质和粘附分子( F N 、L 。、T e n a c i s n 、l a m i n i n ) 等啼1 。O E C s 的生物学作用最早体现在促进嗅觉神经元的生长，它包裹着整个轴突，为轴突的生长提供一个适宜的环境。R a m o n C u e t o 等H 1 发现将大鼠脊髓半切，然后将培养的O E C s 植入损伤部位，3 7 周后动物恢复了运动和感觉的功能反射，且后肢能够自主运动，还能站起来承受一定的体重，同时对比较轻的刺激和本体感觉有了明显的反应；另外形态学观察到许多下行纤维向尾侧断端长距离生长。K a r v e 等晦1 将成年大鼠嗅球来源的O
3、E C s 悬液注射入大鼠完全横断胸髓两边的多个部位，7 个月后大鼠重新获得了用瘫痪下肢爬行的能力，同时皮肤可因刺激引起感觉反射。L u 等m 1 报道纯度为9 8 的O E C s与纯度为5 0 的O E C s 植入S C I 处，动物模型各项恢复指标无统计学差异。在实验性脱髓鞘损伤中移植嗅球来源不纯的O E C s ，其轴突髓鞘的再生竟然是提纯了O E C s 的三倍”3 。污染的嗅球外膜细胞增强髓鞘再生的原理还不清楚，可能是这些细胞可以释放O E C s 分裂素、趋化因子作用于轴突的胞外基质，从而促进了髓鞘化。尽管如此，所有移植手术必须解决的一个根本问题免疫排斥反应。尽管C N S 存
4、在免疫特免性，但是完全的免疫特免器官是不存在的。在同种异体或异种问移植时免疫排斥仍然存在。因此，除非自体移植，或找到组织配型一致的供体，克服免疫排斥反应仍是异体或异种脊髓内移植所必须研究的问题。自体移植由于供体来源有限，且会给患者造成二次创伤，而难以被临床接受。以往通过紫外线照射、低温培养及冷冻等试图降低移植物的抗原性，效果都不理想；免疫抑制剂是有效的，能使移植物长期存活并发挥作用，但其副作用大，价格昂贵，长期应用还有潜在致瘤的危险。另外，有学者使用胚胎神经组织移植，能克服免疫排斥反应，但是，供体来源并不充裕，而且受到道德的制约。如何寻找到一种供体来源不受限制，移植效果好、副作用小且又不会产生
5、免疫排斥反应的移植物已成为人们孜孜不倦的追求。微囊技术是一个良好的免疫隔离手段，其原理是将移植物置于用高分子聚合物制成的生物相容性的选择性半透膜中，隔离移植物和受体免疫系统，而对小分子营养物质、有生物活性的分泌物质以及代谢产物具有通透性。微囊是用亲水性高分子材料与细胞混匀，从喷嘴喷出的同时，经外周高速气流的作用，在组织表面成型，此时遇二价阳离子溶液，迅速发生交联，使其凝胶化成直径5 0 8 0 啪的包裹组织的球囊。制作微囊的主要材料有：海藻酸钠( a l g i n a t e ) 、多聚赖氨酸( p o l y l y i n e ) 、多聚鸟氨酸、壳聚糖、脱乙酰几丁质、琼脂糖、聚丙烯酰胺及
6、羟甲基纤维素钠等，其中以L i m 和S u n 呻1 发明的海藻酸钠一多聚赖氨酸一海藻酸钠( A P A ) 微囊技术最成熟，具有很好的生物相容性，可阻隔分子量大于1 1 1 0 4 k u 的物质，从而可以隔离分子量在1 6 1 0 4 k u 左右的抗体及免疫活性细胞，起到免疫保护作用。同时，支持细胞生长的小分子营养物和生长因子可自由通过微囊膜，以满足微囊化细胞生存的基本营养需要。1 。S u nY L 等“叩研究发现将A P A 微囊移植可以保护异种细胞在宿主动物体内存活并维持2 6 个月之久，且无明显的毒副作用。最近又有实验表明阻”，利用一步法微囊包裹技术，成囊时间短，使得A P A
7、 囊包裹更简单。L a n z a 等通过使用不同浓度的海藻酸钠和不同分子量的P L L ( 分子量 9 5 后，将细胞悬液与1 5 海藻酸钠( S i g m a ) 生理盐水溶液1 ：1 混匀，经双腔喷头将其喷入2 0 咖o l L 的氯化钡生理盐水溶液中，轻摇混匀后静置沉淀，吸去上清，生理盐水洗涤2 次，最后将所得微囊悬浮于生理盐水中，生理盐水量以刚好没过沉淀的微囊为宜( 见附图1 ) 。2 3 动物分组及移植操作2 3 1 动物分组：S D 大臼鼠( 存活) 9 6 只，体重( 2 2 0 2 5 0 9 ) ，雌雄不拘。随机分为：A 正常对照组6 只、B 单纯损伤对照组3 0 只、c
8、 组兔嗅球细胞移植组3 0 只、D 微囊化兔嗅球组织细胞移植组3 0 只，其中B 、C 、D 组每组于术后1 2 h 、1 d 、3 d 、7 d 、2 1 d 这5 个时相点各取6 只S D 大白鼠灌注取材。2 3 2S C I 模型及移植程序：健康S D 大白鼠腹腔麻醉( 3 戊巴比妥钠3 0 m g k g )成功后，以T 。为中心，取背部正中线切口，逐层切开，暴露T 。棘突及椎板，打开椎管，正中线切开硬膜后，用虹膜刀垂直插入横向切开脊髓，并截取l m m脊髓组织。A 组仅打开椎管，暴露脊髓不作移植；B 组仪用明胶海绵填塞S C I腔隙；C 组植入吸附细胞悬液的明胶海绵块；D 组用与断端
9、腔隙大小相吻合的明胶海绵块吸附l O u l 的微囊化细胞，植入洞腔；术后用9 一O 丝线缝合硬脊膜，卜0 丝线依次缝合切口。术后单笼饲养，每日3 次挤压膀胱协助排尿，各组均不使用免疫抑制剂( 见附图2 ) 。2 4 行为学评分按B B B 法对大鼠术后运动功能的恢复情况进行评分。B B B 评分共分2 2 级，最低分0 分，最高分2 1 分，具体评分等级参见B a s s o 等的评分项目表“。由于动物昼夜活动量差异较大，所有观察均在上午进行。评价前将动物的膀胱排空，以免因膀胱充盈而影响活动。B B B 评分观察期为4 m i n ，动物尽量保持在活动范围的中心区域活动。B B B 评分项目
10、表分数特征说明0无可观察到的后肢运动j1 或2 个H L 关节轻度活动21 个H L 关节大幅运行和另一关节轻度活动32 个H L 关节大幅运行4所有3 个H L 关节轻度活动52 个H L 关节大幅运行和第3 个关节大幅运动62 个H L 关节大幅运行，第3 个关节轻度活动7所有3 个H L 关节大幅运行8不负重拖动或足置于不负重位H L ：( h i n d - l i m b ，I l L ) 后肢轻度：5 关节活动范围大幅： 5 0 关节活动范围2 个关节：通常为髋和膝3 个关节：髋、膝、踝第3 个关节：通常为踝拖动：节律性伸展3 个H L关节，身体侧卧9l O足底仅位于负重位，或偶尔
11、频繁持续以足背重步行，无足底重步行偶尔负重步行，但前、后肢不协调i 1由频繁到持续负重步行，但无前、后肢协调1 21 31 41 61 71 81 92 0由频繁到持续负重步行，偶见前、后肢协调由频繁到持续负重步行，频繁前、后肢协调持续协调足底步行，优势爪在刚接触地和抬起时旋转；频繁足底步行，持续前、后肢协调，偶尔足背侧步行持续协调足底步态，当前肢向前时无或偶有仲趾，优势爪在刚接触地时平行持续协调足底步态、频繁伸趾，优势爪触地时平行，抬起时旋转持续协调足底步态，频繁伸趾，优势爪在触地及抬起时均平行持续协调足底步态，持续伸趾，优势爪在触地及抬起时i I i 行基本内容同1 8 ，尾在部分或全部观
12、察期中下垂摹本内容同1 8 ，尾持续上翘，但躯体不稳2 l基本内容恳2 0 ，且躯体持续稳定负重：足底重位时或仅在后躯干抬高时H L 伸肌收缩偶尔： 5 且5 0 ，步行：足底负重触地 J L 前置便足底再次触地频繁：5 1 9 4 观察期；持续：9 5 1 0 0 观察期6 5 0 9 6 协调运动5 1 9 5 协调运动旋转：当其触地或抬起时后爪向外旋转平行：后爪在刚触地或抬起时与躯干平行；伸趾：听趾拖踏音，即足音中无趾拖踏音频繁伸趾：一半以上足音中趾无拖踏音持续伸趾：4 m i n 观察期中仅有4 次趾拖踏音尾上翘：不触地，躯干不稳，当快速移动时，重心侧移，出现摇摆、倾斜、滑倒躯体持续稳
13、定：无滑倒，骨盆环与尾在运动时保持一直线2 5 灌注与取材每组术后1 2 h 、i d 、3 d 、7 d 、2 1 d 随机各取6 只S D 大鼠麻醉、开胸暴露心脏，经升主动脉插管，快速灌注生理盐水1 0 0 m l ，然后灌注4 多聚甲醛( p H 7 4 ) 2 0 0 m l 。截取移植部位或损伤节段约1 0 r a m 长脊髓组织，入4 多聚甲醛后固定2 4 h ，在半切平面处断开成上下两段。各段标记后用流水冲洗脱水，透明，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5Bm ；正常组取相应处脊髓切片。分别行N i s s l 、原位末端标记及H E 染色。2 6T U N E L 染色石蜡切片置6
14、8 。C 烤箱中烤4 5 m i n , 取出室温过夜，然后按照以下步骤进行：1 ) 二甲苯I 、I I 各5 分钟( 新鲜二甲苯) ；2 ) 无水乙醇I ：5 分钟；3 ) 无水乙醇I I ：3 分钟；4 ) 9 5 乙醇：3 分钟；5 ) 8 5 乙醇：3 分钟；6 ) 7 0 乙醇：3 分钟；7 ) 5 0 乙醇：3 分钟；8 ) 0 8 5 氯化钠洗脱5 分钟；9 ) P B S 洗脱5 分钟；1 0 ) 4 多聚甲醛室温1 5 分钟；1 1 ) P B SI 、I I 各5 分钟；1 2 ) 移去组织上的P B S ，将载玻片置于平板上，向组织上加2 0 u g m l 的蛋白酶K
15、溶液1 0 0 u l ，3 7 。C 孵育l O 分钟；1 3 ) P B S 洗5 分钟：1 4 ) 4 多聚甲醛P B S 室温5 分钟；1 5 ) P B SI 、I I 各5 分钟；1 6 ) 轻拍玻片，去除多余的水，用1 0 0 u l 的平衡缓冲液覆盖组织，室温平衡5 分钟；1 7 )当切片平衡后，融化生物素核酸混合液( 在冰上) ，准备足够的用于实验和对照反应的r T d T 反应混合液，放在冰上。标记反应混合液配法如下：以一个标本的量为例：r 平衡缓冲液：9 8 u i_ 生物素核酸混合液：1 u llr T d T ：l u l阴性对照的标记体系中用蒸馏水代替r T d T
16、 ，其余的相同；1 8 ) 用薄纸围绕平衡区，蒯组织上加l O O u l 的标记液，注意勿使切片过干；1 9 ) 用塑料薄膜覆盖切片，以使标记液更好的分布。玻片在3 7 。C 孵育6 0 分钟，以使末端标记发生；2 0 ) 移去塑料薄膜将玻片浸入2 S S C 室温1 5 分钟，以终止反应：2 1 ) 将玻片浸入新配的P B S 5 分钟：2 2 ) P B S 洗5 分钟；2 3 ) 0 3 H t o z 室温3 5 分钟，以阻断内源性过氧化物酶i2 4 ) P B SI 、I I 各5 分钟；2 5 )向组织切片加1 ：5 0 0 的H R P I O O u l ，室温孵育3 0 分钟；2 6 ) P B SI 、I I 各5 分钟；2 7 )向切片加l O O u l 的D A B 显色液，镜检，直到出现亮黄色背景为止，大约需要1 0 分钟左右，镜检；D A B 显色液的配制：r D A B 底物缓冲液：5 0 u ll 蒸馏水：9
