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1、柱前荧光衍生 2 高效液相色谱法测定尿和血清中的环境雌激素毛丽莎 孙成均3李永新 吴德生 赵剑虹(四川大学华西公共卫生学院,成都610041)摘 要 建立了同时测定人尿和血清中环境雌激素双酚A、42 壬基酚、172 乙炔基雌二醇及内源性雌激素雌三醇、172 雌二醇和172 雌二醇的对硝基苯甲酰氯柱前荧光衍生 2 高效液相色谱测定方法。尿样经酸水解、固相萃取柱浓缩、 净化分离;血清样品经乙腈沉淀蛋白后,用乙醚萃取游离态雌激素,N2气流挥干、 在无水条件下,雌激素与对硝基苯甲酰氯反应生成荧光产物,用高效液相色谱法定量。检出限为2. 78. 3g/L;加标回收率尿样为78. 0%102. 5% ,血
2、清样为72. 6%98. 6%;方法精密度为1. 29%4. 52%。应用本法对20份尿样和10份血清样进行了测定,结果满意。关键词 柱前荧光衍生,高效液相色谱法,固相萃取,尿样,血清,环境雌激素2003212210收稿; 2004205217接受 本文系国家自然科学基金重点资助项目(No. 30030120)1 引 言近年来,关于外源性化学物质干扰人类和动物内分泌系统,影响健康和生殖的研究日益增多。这些外源性化学物质中有一类具有雌激素活性,可模拟内源性雌激素的生理、 生化作用,或具有拮抗雄性激素的效应,被称为环境雌激素(environmental estrogens)1 。目前已报道的主要有
3、人工合成的药用雌激素、 植物性雌激素、 真菌性雌激素、 农药、 工业化学物质等。另外,有些内源性雌激素,如雌二醇、 雌三醇等也可通过人类和动物的代谢产物排入环境,对水体生物产生不良影响。环境雌激素不易降解,可通过 水、 食物、 空气等介质直接或间接进入人或动物体内,干扰内分泌系统的功能,从而对机体的生殖发育、神经系统和免疫系统等产生多方面的影响。所以,测定尿样和血清中的环境雌激素水平,可反映人体接触状况,为正确评价人体环境雌激素暴露水平提供科学数据。环境雌激素的化学测定法主要有气相色谱法2 、 高效液相色谱法35 、 气相色谱 2 质谱联用法6 和液相色谱 2 质谱联用法7等。柱前荧光衍生 2
4、 高效液相色谱法测定环境雌激素鲜有报道。在作者前期工作8的基础上,利用荧光试剂对硝基苯甲酰氯(p2nitrobenzoyl chloride)作衍生剂,与上述被测化合物进行柱前衍生,然后用高效液相色谱法进行分离测定。本法具有衍生反应可于室温下进行,反应速度快,方法简便快速,灵敏准确和操作步骤较简单等特点。适宜于尿样和血清样品中雌激素的测定。2 实验部分2. 1 仪器及试剂HP1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司) ,附荧光检测器; Luna 5C18色谱柱: 5m,250 mm4. 6 mm、 保护柱(美国Phenomenex公司)、ENV218型C18SPE柱、 固相萃取装置(美
5、国Supelco公司)。乙腈(色谱纯) ;甲醇(色谱纯) ; 0. 10 g/L对硝基苯甲酰氯(分析纯)乙腈溶液;Milipore超纯水(1812 Mcm) ;标准溶液:准确称取双酚A、42 壬基酚、172 乙炔基雌二醇、 雌三醇、172 雌二醇、172雌二醇(均为Sigma试剂)各1. 00 mg,于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度作为标准贮备液,临用前用甲醇稀释成10 mg/L混合标准应用液;其它试剂均为市售分析纯。2. 2 色谱条件流动相为乙腈 2 水,梯度洗脱条件为30%乙腈(V /V) 012 min线性增加至70% , 1212. 3 min从70%变为100%。流速1
6、mL /min,荧光检测,采用波长切换,在08. 4 min,激发波长282 nm,发射波长315 nm, 8. 4 min后激发波长切换为228 nm,发射波长为316 nm。进样量20L。第33卷2005年1月分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告Chinese Journal ofAnalytical Chemistry第1期33362. 3 标准曲线制备 分别取0. 0、10. 0、20. 0、40. 0和100. 0L混合标准应用液置于5支2 mL刻度离心管中,弱氮气流 挥干。各加入0. 10 mL对硝基苯甲酰氯乙腈溶液,摇匀后于暗处放置30 min,再加入0. 40 mL 3
7、0%乙腈 2 水,离心后,取上清液进样。2. 4 样品预处理2. 4. 1 尿样 吸取尿样0. 50 mL置于10 mL具塞离心管中,依次加入0. 05 mL浓盐酸, 0. 50 mL甲 醇,于80 水浴中作用1 h后取出,用5 mol/L NaOH溶液调溶液pH至3左右。每次调pH前,须用对 照尿样估计所用NaOH溶液量。样液过ENV218 SPE小柱(过柱前, SPE小柱分别用10 mL甲醇和5 mL水活化)。然后用二氯甲烷5. 0 mL分两次洗脱,合并洗脱液,过无水硫酸钠小柱脱水,氮气挥干。然后图1 标准及样品色谱图Fig . 1 Chromatograms of standards a
8、ndsamples1.雌三醇( estriol) ; 2.双酚A ( bisphenol A) ;3. 172 雌二醇(172estradiol) ; 4.172 雌二醇(172estra diol) ; 5.172 乙炔基雌二醇(172ethinylestradiol) ; 6. 42 壬基酚(42nonylpheonl)。按2. 3节所述方法进行衍生。2. 4. 2 血清 吸取血清0. 50 mL于10 mL具塞离心管中,加入2. 0 mL乙腈沉淀蛋白后,再加入1. 0 mL 1 mol/L HCl,1100 mL甲 醇和2. 0 mL H2O,用8. 0 mL乙醚分3次液液萃取,合并提取
9、液,于40 水浴弱N2流下挥干。然后以2. 3节所述方法进行衍生。 衍生后的样品按标准曲线制备方法进样测定。标准及样 品色谱图见图1。3 结果与讨论3. 1 色谱条件的选择3. 1. 1 检测波长的选择 分别对各标准衍生产物的激发和发 射波长进行扫描,结果显示,两种异构体雌二醇、 雌三醇的最大 激发和发射波长分别为282和315 nm;双酚A、42 壬基酚、172乙炔基雌二醇的最大激发波长和发射波长分别为228和316nm。由于双酚A、172 雌二醇、172 雌二醇、172 乙炔基雌二醇的保留时间接近,因本次实验的主要目的是测定3种环境雌激 素,另外样品中雌二醇含量较高,所以选择雌三醇的激发波
10、长 为282 nm,发射波长为315 nm;其余激发和发射波长均分别设 置为228和316 nm。3. 1. 2 流动相组成、 柱温和流速的选择 流动相的组成对保留时间影响很大。实验考察了甲醇 2 水和乙腈 2 水两种流动相。由于甲醇 2 水不能完全分离6种衍生物,且 峰型不理想,而乙腈 2 水分离效果好,故选择乙腈 2 水作流动相。研究了不同的梯度洗脱条件对分离的影 响。经过多次实验,最后选择012 min乙腈由30% (V /V)增加至70% ,在1212. 3 min,乙腈由70% 快速增加至100% ,并保持至20 min。通过梯度洗脱,可以在20 min内同时基线分离6种衍生物。 保
11、持其他条件不变,对柱温(1530)、 流动相流速(0. 81. 5 mL /min)进行实验,根据最终的峰型和分离情况,选择柱温25 和流速1. 0 mL /min,分离度满足要求,且峰型也好。3. 2 衍生化反应条件的选择 所研究的6种被测化合物除42 壬基酚和双酚A外,其余4种化合物本身的荧光强度较弱,直接荧 光检测的灵敏度低。故采用对硝基苯甲酰氯为荧光衍生剂,与6种雌激素在无水环境中发生荧光衍生 化反应,生成具有强荧光物质。衍生化后, 172 乙炔基雌二醇、 雌三醇和两种异构体雌二醇的荧光效率明显提高。3. 2. 1 衍生化反应时间的选择 保持衍生化的温度和衍生剂用量不变,将同一浓度混合
12、标准溶液与衍 生剂反应不同时间后测定。结果表明,反应30 min,各化合物峰面积达最大且趋于稳定,故本法选择反 应衍生化时间为30 min。3. 2. 2 衍生化反应温度的选择 衍生化反应温度对衍生物的产率和稳定性有显著影响。固定其它反43 分 析 化 学第33卷应条件不变,在不同温度下进行衍生化反应后测定。结果表明,在450,各衍生物峰面积可达最大, 超过50 后,峰面积逐步下降,本法选择衍生化温度为室温(25)。3. 3 样品处理条件实验3. 3. 1 尿样 雌二醇在尿液中主要与硫酸或葡萄糖醛酸生成的结合形式存在7 ,雌激素游离态低于10%。故需把结合态水解成游离态。水解方法主要有酶水解法
13、和酸水解法,本实验采用酸水解。对水 解时间(10 min、30 min、1 h、2 h)、 水解温度(25、50、70、100)、 水解酸度(0. 2 mol/L、0. 6 mol/L、1. 0 mol/L、2. 0 mol/L)进行三因素四水平的正交实验,对各条件进行最优化选择。实验结果表明,当水 解时间为1h,水解温度为70,水解酸度为0. 6 mol/L时,水解效率达最高。3. 3. 2 血清 本研究拟对血清中游离态雌激素的含量进行测定。采取有机溶剂提取血清中的雌激素, 实验了甲醇、 乙酸乙酯、 丙酮、 乙醚、 二氯甲烷和正己烷的提取效率。结果显示,除乙醚外,其他有机溶剂 的提取效率均不
14、理想。经乙醚提取3次后,除雌三醇提取效率为70. 6%、42 壬基酚为73. 0%外,其余均 达99%以上,所以本法采用乙醚溶剂提取3次。3. 4 衍生产物稳定性实验将衍生后的溶液分别放置0 h、1 h、2 h、4 h、1 d及2 d后测定,结果显示,在24 h内,衍生产物峰面 积无显著变化。3. 5 方法的线性范围和检出限 在最佳实验条件下,本法线性范围上限至少可达1. 0104g/L;相关系数达0. 999以上。以2倍信噪比(S /N=2)作为方法的检出下限,双酚A、172 雌二醇的检出限为2. 7 g/L、42 壬基酚为2. 9g /L、172 雌二醇和172 乙炔基雌二醇为4. 6g/
15、L、 雌三醇为8. 3g /L。3. 6 精密度实验 本法确定的实验条件下,将不同浓度的混合标准溶液于同一天内连续5次测定,根据峰面积计算得 到42 壬基酚、 双酚A、172 乙炔基雌二醇、 雌三醇、172 雌二醇、172 雌二醇的相对标准偏差分别为4152%、3. 92%、2. 99%、1. 29%、2. 60%和3. 31%。3. 7 标准加入回收实验 对不同尿样进行不同浓度水平的加标回收实验,结果表明,本法回收率范围尿样为78. 0%10215%;血清样为72. 6%98. 6%。4 样品分析用本法对20份正常人尿样和10份血清样品进行了测定,结果见表1。因收集的尿样和血样来源 于不同个
16、体,所以不能比较尿样和血样中这些雌激素含量的相关性。国外曾报道双酚A从食品容器的释放量最多可达23g/can9 。对于非职业人群的42 壬基酚的日暴露量的流行病学调查显示人群经口 摄入量每日低于0. 16 mg10 ,也有报道42 壬基酚在市场上鱼类产品的含量为9800 ng/g。表1 尿样和血样测定结果 Table 1 The contents of target compounds in urine and serum雌激素 Estrogens尿样Urine sample (n=20) 含量范围 Content range (mg/L)?XS (mg/L)检出率 Percentage of detection (% )血样Serum sample (n=10) 含量范围 Content ra
