电泳的原理、应用及进展

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1、知识介绍电泳的原理、 应用及进展（ 上）蔡仕英姚志建 （ 军事医学科学院基础医学研究所， 北京， 1 0 0 8 5 0 ）一 、 概述电泳（ E le c tr o p h o r e s is 是一种带电 粒子在电场中泳动的现象。早在 1 8 0 8 年就已发现这一现象 ， 但直 到 1 9 3 7 年瑞典的T is e liu s 建 立了 “ 自 由电 泳法” ， 成功地将血清蛋 白分成 5 个主要成分， 即清蛋 白、1 - 、 2- - 和- 球蛋白， 才使电泳技术在生化分析中 得到 应用。 经 过不断 地努力， 特别是近3 0 年的发展， 电 泳 技术从理论到实践都得到了很大的发展

2、和完善， 已成为蛋白质、 核酸分析中不可缺少的方法。 带电粒 子在电场中的运动速度（ 电 泳迁移 率） 与电场强度及粒子的净电荷、 质量、 形状及介质阻力等许多因素有关。 根据库仑定律， 一个净电荷为Q的粒 子在电场强度为E的电 场中所受的力为： F = Q E 。 它在运动时受到的阻力F与粒子形状有关， 对于球形粒子它服从 S t o k e 定律 ： F 6r v ， 其中 r 为粒子 半径，为介质粘度， v 为泳动 速度。 稳态 时电 动力与 阻 力 相 等 F = FQ E = 6 r v V E Q称 为 电 泳迁移率， 记为 u 。由此可见， 在一定介质中一定） 不 同粒子带净电荷

3、Q不同或半径不同时， 在电 场中的 迁移 率就不同， 据此可 将不同 粒子分开。 这是一种 理想情况。 在实际条件下迁移率还受许多因素的影响， 如粒子所带净电 荷就与环境p H 值有关等。基于以上介绍的基本原理 ， 在实际应用中由于 研究 对象及目 的等不同， 电 泳又分许多种类， 较常用的如表 1 所列。 下面就其中一些方法、 原理及进展作些介绍。二、 蛋白质电泳由不同氨基酸残基以肽键连接在一起的蛋白质 分子都是两性电 解质， 其 所带净电荷随环境p H值变 化而改变。 基于这一特征， 可用电 泳技术将不同的蛋 白 质分开， 并进行理化性质及免疫学特征 分析。 应用 最广泛的蛋 白质电泳是聚

4、丙烯酰胺凝胶 电泳P o l y a c r y la m id e G e l E le c t r o p h o r e s is ， 简称P A G E， 其 次 还有醋酸纤维膜电泳及琼脂糖凝胶电泳。表 1 常 用电泳技术的分类用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物始于六十年 代初。 聚 丙烯酰胺是由 单体丙烯酰胺和共聚单 体 N ， N - 甲 叉双丙烯酰胺交联共聚的产物。由 于乙 烯基的 聚合作用形成丙烯酰胺链的交联， 从而构成了三维 空间的凝胶网络。凝胶网络的孔径受丙烯酰胺浓度 及甲 叉双丙烯酰胺浓度的影响， 它们的浓度越高， 制得的凝胶孔径就越小。 所以在分析样品时， 要选择合 适的凝

5、 胶浓度。 表2 列出了一 些参考数 据。 丙烯酰胺聚合成凝胶是一个 自由基催化反应 ， 根据自由基产生方式的不同可分成两类， 即光聚合和化学聚合。 光 聚合一般是在核黄素- 四甲 基乙二 胺催 化下 进行。 化学聚合常用过硫酸铵催化， 也可用双氧水催化， 促进 剂有四甲 基乙 二胺、 硝酸银等。表 2 样品分子量与对应的凝胶浓度用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物具有许多优 点： 1在一定浓度范围内是透明的， 机械强度好， 有弹性， 化学稳定性好； 2丙烯酰胺没有带电的基团， 电 泳时不产生电 渗 3可根据需要控制凝胶浓度， 制 成不同孔径的凝胶； 4把分子筛效应和电荷效应结 合在一起， 具有很高

6、的分辨能力； 5样品用量少， 电泳时间短， 设备简单。 以聚丙烯酰胺作为支持物的电泳方法很多， 这 里重点介绍一下S D S - 聚丙 烯酰胺电泳、 等电 聚焦电泳及双向电泳。（ 一） 蛋 白 质 的S D S - 聚丙烯酰胺电泳 在一 定p H 条件下， 绝大部分蛋白 质都带一定 量的净电荷， 在电场作用下用聚丙烯酰胺凝胶可以将 它们分开。 但由 于被分离的 各蛋白 组分本身所带的 净电荷不同， 以 及分子的 大小 及形状等因素影响， 分 离出的蛋白 质很难作进一步的分析。 还有， 对于等电 点刚 好等于电 泳系 统p H 值的 蛋白 质， 用这种方法就 无法进行分离。 由 于诸多缺点， 人

7、们 对单纯依 赖蛋白 质本身所带净电 荷进行分离的电泳并不满意， 于是 S h a p ir o 等人发明了S D S - 聚丙烯酰胺凝胶电 泳（ S D S -P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s ， 简称 S D S - P A G E ） 在该电泳系统中， 当蛋白质的分子量在1 50 0 0 - 2 00 . 0 0 0 之间时， 电泳 迁移率与分子量的对数呈线性关系。这在分离、 鉴定蛋白质， 确定蛋白质分子量上是很有意义的。 S D S - P A G E电泳的基本原理是： 阴离子去污剂 S D

8、S （ 十二烷基磺酸钠） 能破坏蛋白质 分子之间以及 与其它物质分子之间的非共价键， 使蛋白质变性而改变其原有的构象， 并同蛋白质分子充分结合形成 带负电 荷的蛋白 质 - S D S 复合物。 在强还原剂巯基乙 醇等存在下， 蛋白 质分子内的二硫键被打开并不易 再氧化， 可以 保证这种结合更加充分。 结合了S D S 的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒， 不同的 蛋白 质- S D S 复合物其椭圆棒的 短轴长度是恒定的， 约为 1 8 ， 而长 轴的长度则与蛋白 质分子量的大小 成正比。 这样的蛋白质- S D S 复合物在电场作用下， 其 迁移率便不再受蛋白质 原有的净电荷及形状等因

9、素的影响， 而主要取决于其分子量大小这一因素。 根据 这一 特点， 就可以 将各蛋白 组分按分子量 大小 分开。 S D S - P A G E电 泳按所制成的凝胶形状和电 泳方 式可分为 垂直柱型电 泳及垂直板型电泳； 按电泳系 统中 的缓冲液、 p H 值和凝胶孔径的不同又分为连续电泳和不连续电泳。 组合起来共有四种形式， 其中最 常用的 是垂直 板不 连续电 泳。 这是因为： 1 S D S - 不连续电泳的上层胶具有较强的浓缩效应， 分辨率高， 分离效果好； 2垂直板电泳易散热， 保持板内凝胶温度 合适； 3 垂直 板电 泳一次可上多个样品， 便于结果的 分析比 较； 4 垂直 板内凝

10、胶的厚薄易于控制； 5垂直 板电 泳后的凝胶还可进行转印电泳； 6凝胶便于染色、 脱色、 进行薄层扫描分析及干胶保存等。 S D S - P A G E 电 泳在蛋白 质化学中应用十 分广 泛， 可用于蛋白 质的鉴定分析、 分离纯化、 分子量的测定 以 及亚基组分的分析等。 （ 二 ） 蛋白 质的 等电 聚焦电 泳作为两性电解质的蛋白质， 其带电量随 p H的变 化而改变， 当p H等于某蛋白 的等电点时， 该蛋白在电场中就不会迁移。等电聚焦电泳就是根据这一原 理而设计的， 即在p H 梯度环 境中它能使各种蛋白 质按等电点的不同而分开。可见进行等电聚焦电泳的首要条件是创造一个 p H梯度环境

11、。根据这一需要 ， 1 9 6 6年 V e s t e r b e r g合成了载体两性电解质 A m p h o lin e， 在电 场作用下， 它能在一定范围内 形成 p H梯度。 载体两性电解质是由许多 脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成的， 分子量一般小于 1 0 0 0 ， 通过改变每个分子中氨基和羧基的比 例得到 不同 等电 点化合物从而能形成p H梯度。 作为 理想的 载体两性电解质需具备以下条件： 1缓冲能力强、 可溶性好； 2导电性好； 3紫外 2 8 0 n m吸收低； 4易从聚焦的蛋白质中脱出； 5无生物学效应。 在实验中根据研究对象的等电点特征， 可选用合适的载

12、体两性电解质。 等电 聚焦电 泳的支持物有聚丙烯酰 胺凝胶、 琼 脂糖凝胶及蔗糖溶液等。 蔗糖溶液作为支持物主 要 用于制备型等电 聚焦。 等电 聚焦作为一种有效的 制 备方 法， 有许多独到的 优点， 如样品的 理化性质及生物学特征基本不变， 由于聚焦效应， 对原来很稀的样 品可起到浓缩作用。 分析型等电 聚焦多以聚丙烯酰 胺凝胶作为支持物， 较常用的 是薄层等电 聚焦（ 胶厚 0 . 5 m m薄层等电 聚焦具有许多优点： 1节省试 剂。 胶薄， 试剂用量 少， 特别是载体两 性电解质。 2胶 板大， 可以在同等 条件下 分析比 较多 个样品。 3由 于 聚焦 效应， 样品用 量少， 分辨

13、率高。 4电 泳时间短（ 一 般 1 2 小时） ， 散热速度快。 5可用 表面电 极直接在 胶板上测定p H . 以 便观察聚焦效果。 6薄层胶便于固定、 染色、 脱色及干胶保存。 等电聚 焦电泳 对样品有一定要求： 第一， 所分析的目标蛋白的等电点必须在两性 电解质的 p H梯度范围内； 第二， 样品中的盐必须除尽， 因为盐离子干扰蛋白质聚焦； 第三， 样品必须处在溶液状态， 对有 些溶解度较小的蛋白质， 可加尿素促溶（ 一般 6 8 m o l / L。 至于等电聚焦所需的时间， 从 理论上讲， 电 泳电流为零时聚焦效果最好， 但实际上若聚焦电流 已 达最小且稳定不再下降， 则可认为聚焦

14、完毕。 聚焦 完毕后， 凝胶需立即置于固定液（ 1 0 C l3 C O O H ， 1 磺基水杨酸） 中固定 1 小时左右， 再用 脱色液脱 去凝胶中 的两性电 解质， 然后进行染色等处 理。 温度也影响等电聚焦的效果， 温度改变， p H就改变， 且高 温会把凝胶烧糊， 所以一般控制聚焦温度在 4 1 0 。 等电 聚焦在科学研究、 临床医 学、 农业及食品分析等各方面都得到广泛应用， 是测定蛋白质等电点 的重要手段。 而且， 作为一项有生命力的 技术， 它 本身还在不断发展。 1 9 8 3 年R i g h e t t i 教授又发明了固定 p H梯度聚焦法， 其原理是： 采用丙烯酰胺

15、衍生物作为 两 性 电 解 质 ，其 结 构 式 为 ， R 代表羧酸基或叔胺基等， 若取代基R为羧酸基， 则 其质子解离常数p K 7 ， 为酸性； 若取代基 R为胺 基， 则其质子解离常数p K 7 ， 为碱性； 通过类似于浓 度梯度凝胶制备法， 控制酸、 碱两性电 解质的比 例便 可制备出固定p H梯度的凝 胶。 因为在 凝胶聚合过程中， 作为两性电解质的丙烯酰胺衍生物能同丙烯酰胺一起共价聚合而被固定在凝胶内， 形成固定的 p H线性梯度。这就保证了在聚焦过程中， p H梯度不会 因其它因素的影响而改 变， 从而进一步提高了等电聚焦的适用范围和分辨率。（ 三） 蛋白质的双向电泳 前面我们

16、已经介绍了根据等电点不同将蛋白质 分开的等电聚焦电 泳及根据分子量的 大小 将蛋白 质 分开的S D S - P A G E 。 但由 于凝胶的分辨率有限， 且在 多蛋白 组分中等电 点或分子量相同 或相近的蛋白 质 可能不止一种， 如 何同时 将这些蛋白 质分开呢？ 出 于 这一动机， 1 9 7 5 年 OF a r r e l l 等人建立了IE F / S D S - P A G E 双向电泳技术， 即以 等电聚焦作为第一向， 将 蛋白质按等电点不同分开； 然后将已按等电点分开 的 蛋白进行S D S - P A G E ， 作为第二向， 让等电点 相同或相近的蛋白质再按分子量大小分开， 结果使分辨 率大大提高。 若结合同位素标记等技术， 则分辨率将 会更高。 从理论上讲， 细 胞内 分子量和等电 点都相同 的蛋白质几乎没有， 双向电泳可以将所有的蛋白质 分开， 但实际上由 于许多因 素的 影响， 很难达到 这样 的 分离效界， 尤其是对一些较特殊的蛋白 质（ 如碱性 蛋白 ） 还不能有效地分离， 这是因为在电 泳时为了保 证第二向S D S - P A G