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1、第三章、微生物细胞的破碎l微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外， 称为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉 菌产生的糖化酶等)l还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱 性磷酸酯酶等)称为胞内产物。l对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤， 获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，l对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎 ，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎 片的分离。细胞壁的组成和结构l 细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含 物释放出来。微生物的细胞外围通常包括 细胞壁和细胞膜。 l 细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它 主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差， 易受渗
2、透压冲击而破碎。细胞破碎的主要 阻力来自于细胞壁。细菌的细胞壁l 几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架肽 聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细 胞具有一定的形状和强度。l短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L丙氮酸 D谷氨酸L赖氨酸D丙氨酸。l肽聚糖键是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交 替地通过（l4）糖苷键联接而成。短肽接 在N乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形 成了网状结构。革兰氏阳性菌的细胞壁l革兰氏阳性菌的细胞壁较厚（1550 nm），肽聚 糖占40一90，其余是多糖和磷壁酸，l 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.52.0nm）， 最外面还有一较厚的外壁层（810 nm），外壁 层主
3、要由脂蛋白，脂多糖组成。l 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构 ，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所 存在的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程 度大，则网结构就致密。酵母菌的细胞壁l主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比 革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增 加。l细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构 成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状l覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，l再外面是由1，6磷酸二酯键共价连接而成网状 结构的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的复合物，它 可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。真菌的细胞壁l大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合 物，葡聚
4、糖（主要以（13）键连接 ，某些以（l6）键连接），几丁质 （以微纤维状态存在）,糖蛋白。l真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有 关l它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 所以强度有所提高。细胞壁的结构和细胞的破碎l破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结 构的共价键。l在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞 壁的结构和组成显得特别重要，可用来作 为选择溶菌酶和化学方法的依据。微生物细胞的破碎技术机械方法 球磨机 高压匀浆器 X-press法 超声波破碎 非机械方法 酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法l球磨机研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液 与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅 拌或研
5、磨，使达到细胞的某种程度破碎。 这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温 度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器 可得到部分解决。球磨机l高压匀浆器l 采用高压匀浆器 是大规模破碎细胞的 常用方法，利用高压 迫使细胞悬浮液通过 针形阀，由于突然减 压和高速冲击撞击环 造成细胞破裂高压匀浆法 l适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌 和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物 。 X-press法 一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮 液冷却至-25C至-30 C形成冰晶体，利用 500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压 阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的 磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起 的。 该
6、法的优点是适用的范围广，破碎率高， 细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率 高， 该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用 。 超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产 生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘 滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应 力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破 碎。 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不 同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比 革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果 级差。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入 很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。超声波破碎仪酶解法l利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键 ，从而达到破壁的目的。l
7、优点：专一性强，发生酶解的条件温和。l缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小 规模的实验室研究。l溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解 细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使 脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至 低渗溶液中使细胞破裂自溶作用l是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由 微生物本身产生的。l影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓 冲液浓度、细胞代谢途径等。l自溶法在一定程度上能用于工业规模，但 是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白 质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度 也会降低。 渗透压冲击l是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高 渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖 溶液)，入达到平
8、衡后，介质被突然稀释， 或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透 压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起 细胞壁的破裂。l渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌 ，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑 制而强度减弱时才是合适的。 冻结-融化法l将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化 ，反复多次而达到破壁作用。l对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 但通常破碎率很低即使反复循环多次也不 能提高收率。l另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白 质的变性。干燥法l可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和 冷冻干燥等。l空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适 用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳 定的生化物质。l干燥法条件
9、变化较剧烈，容易引起蛋白质 或其它组织变性。化学法l用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质 水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗 漏出来。l某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法 ，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是， 这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带 来分离和回收化学物质的问题。 破碎方法的选择l选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：细胞的数量；所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂 、酶等)的敏感性；要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，尽可能采用最温和的方法；具有大规模应用潜力的生化产品应选择适 合于放大的破碎技术。 破碎率的评价 l破碎率的评价l细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞 数
10、量的百分比数，即：l Y(%)=(N0-N)/N0100lN0原始细胞数量 lN经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数 量l 目前N0和N主要通过下面的方法获得 各种破碎方法的评述 l高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理 量大，速度非常快，目前在工业生长上应 用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易 产生大量的热量，使料液温度升高，而易 造成生化物质的破坏，特别是在超声波处 理时。因此，超声波振荡法主要适用于实 验室或小规模的细胞破碎。l 各种破碎方法的评述 l非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透 压冲击和冻结融解法都属于较温和的方 法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合 起来使用，提高破碎效果。
11、干燥法属于较 激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或 其它组分变性. 破碎方法的选择依据l处理量l高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产l产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及 产物在细胞中的位置l生化物质的稳定性l细胞的数量和细胞壁的强度l破碎程度l提取分离的难易l总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的 能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。破碎率的评价l 直接计数法l在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后 的样品进行计数。l 间接计数法l间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞 释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等 ）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离 掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量 上清中的蛋白质含量。
