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1、第11卷 第3期1998年8月同 位 素Journal of IsotopesVol . 11 No. 3A ug.1998甲胎蛋白干血滤纸 免疫放射分析试剂盒的研制陈 键 刘一兵 韩世泉 王衍真(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)用氯胺T法制备125I2A FPM cA b,用A FPM cA b包被试管,以全血作标准,建立了A FP干血滤纸片免疫放射分析方法。该方法灵敏度为712g?L ,批内变异系数为511%1010% ,批间变异系数为417%816% ,正常参考值10g?L ,与血清A FP免放分析方法比较,相关系数r= 0. 979。关键词 甲胎蛋白(A FP) 干
2、血滤纸 免疫放射分析 单克隆抗体(M cA b)中图法分类号 R730. 45 R817肝癌是常见的恶性肿瘤之一,每年新发病例11102万1,在我国一些地区发病率较高。目 前尚缺乏一种准确、 快速的普查手段2, 3。A FP是原发性肝癌的重要标志物,早已广泛用于临 床诊断、 治疗和研究。 目前国内对A FP的测定大多采用放射免疫分析方法,需要抽取患者的静 脉血作为标本,不利于对肝癌的大面积筛查,尤其是无条件开展放免工作的边远地区。由于A FP干血滤纸片免疫放射分析法只需采少量耳垂血点于特制滤纸片上,阴干后可将样品寄给 检测中心进行集中检测;且该方法采用固相包被管进行分离,很大程度上简化了操作步
3、骤。为 此,拟建立A FP干血滤纸片免疫放射分析方法。1 材料和方法111 主要试剂 采用新生儿脐带血配制A FP标准。Sephadex G225:瑞典Pharmacia产品。N a125I:杜邦公 司产品。包被用试管(12mm60mm ,底六角):黄岩医用塑料厂产品。采血滤纸(8402型):天津造纸研究所产品。其它化学试剂均为分析纯。112 试剂盒组份的制备11211 试剂盒组成 由A FP标准纸片、125I2A FP M cA b、A FP M cA b包被管、 高浓度洗涤液、 采样滤纸等组成。11212 抗A FP M cA b的制备 取经A FP免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2?O
4、,在50%陈 键:男, 26岁,助理工程师,放射免疫专业收稿日期: 1997211226 修改稿收到日期: 1998203213PEG(聚乙二醇)作用下进行融合,铺于96孔板,置5%CO2培养箱中37培养,当细胞群落 长至1?3孔大小时,用R I A方法筛选。将呈抗体阳性的细胞按有限稀释法进行克隆化至所有 细胞孔均呈抗体阳性为止。 将克隆化成功的杂交瘤细胞扩大培养,注入已用降植烷处理的小鼠 腹腔,一周后收取腹水。11213 抗A FP M cA b的提纯4 取小鼠腹水与2倍于腹水体积的0106 mol?L pH5. 0的乙 酸缓冲液混和,pH调至418。 室温搅拌状态下逐滴加入辛酸(每毫升加入
5、25L辛酸)。 再搅拌30 m in, 11 000 r?m in离心30m in,取其上清液对0105mol?L pH714磷酸盐缓冲液透析,用紫 外光吸收法测其A FP M cA b的浓度。11214 125I2A FP M cA b的制备 采用氯胺T法对A FP M cA b进行碘标记,标记率为80%90% ,经Sephadex G225柱层析分离纯化,放化纯度 90% ,比活度为740 GBq?g。11215 A FP标准纸片的制备 将加过抗凝剂的健康人全血离心,取血球并用生理盐水洗涤 三次。将血球与小牛血清按一定比例混匀,并加入脐带血配成A FP浓度分别为0、10、30、100、20
6、0、400、800g?L的标准品,分别取30L点于滤纸上,室温下阴干后, - 20冷冻贮存。11216 A FP M cA b包被管的制备 用011mol?L pH9. 5的碳酸盐缓冲液配制成A FPM cA b 包被液,将包被液加入试管4过夜,第二天用含1%BSA、0102 mol?L pH7. 4的磷酸盐缓冲 液封闭,并加入保护剂保护, 4保存。113 操作方法 实验用试管(除T管)均用试剂盒配备包被管。标准品和样品滤纸用6 mm打孔钳将干 血片打入试管。按表1加样。洗涤三次后,用吸水纸吸干试管口残液。测各管放射性计数。表1 试剂盒分析程序试管组T管标准管样品管标准1片样品1枚125I2A
7、FPM cAb2502502504过夜,倒出管内纸片洗涤液500500114 AFP测定的影响因素11411 提取缓冲液的选择 配制A FP浓度分别为0g?L和600g?L的全血,并加入一定 量的125I2A FP,混匀。以每点30L点于滤纸上,室温下阴干。分别用不同浓度不同pH的磷酸 盐缓冲液4过夜提取。第二天挑去纸片,测各管内液体的放射性计数,以对比不同缓冲液的 提取效果。11412 纸片均匀度和提取率的测定 用125I2A FP作示踪剂,分别配制A FP浓度为0g?L和700g?L。血球体积百分含量为50%的全血,随机抽取10张纸片,以每点30L点于纸片上, 每张纸片点6个点,室温下阴干
8、。将血片用6mm的打孔钳打入试管内。测其放射性计数,分 别算出同一纸片内各点间和不同纸片间的变异系数。用提取缓冲液4过夜提取。第二天挑 去纸片,测各管内液体的放射性计数,计算各管的提取率。11413 血球体积百分含量对A FP测定的影响 分别配制A FP浓度相同、 血球体积百分含量531 第3期 陈 键等:甲胎蛋白干血滤纸免疫放射分析试剂盒的研制分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的全血,以每点30L点于 纸片上,室温下阴干后,将血片用6 mm的打孔钳打入试管内,并用提取缓冲液4过夜提 取,测出不同纸片提取液的放射性计数。2 结 果211 AF
9、P IRMA标准曲线图1 A FP IRMA标准曲线以各标准管放射性计数率N的常用对数为纵座标,以标准品浓度的常用对数为横座标作图 得A FP IRMA标准曲线,示于图1。本试剂盒的 检测范围为10800g?L。212 方法学鉴定 采用测定零标准均值加上2s的方法,估算方法灵敏度为712g?L。批内变异系数为511%1010% ,批间变异系数为417%816%。 分别用该方法和血清A FP免放分析方法对43例样品作检测,两种方法相关系数r=0. 979;其中孕妇全血19例,用A FP纸片IRMA测定x-= 37. 6g?L ,用血清A FP IRMA测定x-= 80. 5g?L。213 提取液
10、的选择 将提取后的纸片挑出,测各管放射性计数,结果列于表2。表2结果表明: pH7. 0- 8. 0磷 酸盐缓冲液浓度为0101011 mol?L时,pH和离子强度的变化对提取率影响不大,其中0105mol?L pH714的磷酸盐缓冲液的提取效果相对较好。表2 不同浓度和pH的提取液对提取效率的影响标准点? gL- 1不同浓度(molL- 1)提取液的提取效率?%0101(pH7. 4)0105(pH7. 4)011(pH7. 4)0102(pH7. 0)0102(pH7. 2)0102(pH7. 4)0102(pH7. 6)0102(pH7. 8)0102(pH8. 0)080. 178.
11、977. 978. 678. 379. 875. 776. 675. 160077. 779. 077. 679. 277. 476. 474. 376. 476. 9注:提取效率指管内提取液放射性计数与原血片放射性计数的百分比;每点各做5管,取其平均值图2 不同血球含量对A FP测定的影响214 纸片均匀度和提取率的测定将过夜提取后的纸片挑出,测各管放射性计 数。测得同一 张 纸 片 内 各 点 间 变 异 系 数 为118%517% ,不同纸片间变异系数为510%514%。提取率均在7610%8011%。215 血球体积百分含量对AFP测定的影响血球含量对全血中A FP测定的影响结果示 于
12、图2。 由图2可知,血球体积百分含量为30%90%时,其变化对全血中A FP的测定影响不631同 位 素 第11卷 大。216 正常参考值取本院职工医院健康人全血样品100例点于纸片上,阴干。用该方法测定正常值为10g?L;用血清A FP IRMA法测得样品正常值5g?L。217 保护剂的选择及包被管的稳定性该试剂盒采用物理吸附的方法制备包被试管时需加入适当的保护剂进行保护。保护剂的对比选择列于表3。表3 保护剂的对比选择标准点浓度? gL- 1加入不同成份保护剂时的结合率?%0?00. 070. 120. 150. 140. 120. 0550. 110. 230. 220. 170. 27
13、0. 2180031. 540. 640. 739. 643. 646. 0注: 0表示未加保护剂从表3中可知:使用加了保护剂的包被管反应结果比未加保护剂的包被管理想,选用保护 剂 保护的包被管做稳定性实验。 将包被管分别置于4、20、37条件下,结果表明使用该保护剂时,包被管在20、37条件下均可稳定放置三周。定期测定4存放的包被管,结果列于表4,由表4可知该包被管在4可存放一年。表4 包被管4存放稳定性实验标准点浓度?gL- 1不同存放时间(月)时的结合率?%248120010701050105010650128013301300137150199111311141133300411243
14、18431145188005911621460156311218 试剂盒稳定性将试剂盒各组份分别置于4、20和37的条件下存放并定期测定。 结果表明除标准纸片、标记物在37放置到第3周时结合率略有下降外,其它均无明显变化。 表明该试剂盒在20条件下可存放3周, 37条件下可存放2周, 4条件下可存放6周。3 讨 论(1)在该试剂盒的研制中使用了两株不同结合位点的A FP单克隆抗体,因此A FP的提取和反应过程是一步完成的,从而简化了操作步骤,缩短了反应时间。 由于测定样品为全血样品,标准品需用相应的全血体系,用人A FP阴性血清配制标准品成本高,且阴性血清来源较困难, 不利于试剂盒的大批量生产
15、。 采用小牛血清替代人A FP阴性血清配制标准品对样品的测定无731 第3期 陈 键等:甲胎蛋白干血滤纸免疫放射分析试剂盒的研制影响,且小牛血清价格低、 易于购买。 (2)正常人全血中血球含量一般为40%50% ,但由于某些疾病或其它原因,人体血液中的血球含量会发生变化。 由于该方法中标准品和样品均采用干血滤纸片,因此就全血中血球含 量的变化对样品A FP浓度测定的影响做了比较。 由图2可知血液中血球体积百分含量在一定 范围内时,样品的测定值受血球体积百分含量变化影响不大。这一结果与文献5报道相符。(3)固相包被管分离完全、 简便、 快速,越来越受到用户的欢迎。 目前,国外试剂盒大都采用固相试
16、管载体包被抗体或抗原技术。固相试管的包被方法分为化学联接和物理吸附两种。化 学联接是利用试管表面的化学功能基团以共价键与抗体或抗原结合。该方法结合牢固、 均一, 但工艺复杂,在一定程度上会影响抗体或抗原的生物活性,而且包被液不能重复使用。用物理 吸附方法试管不需活化,制备简便,抗体包被液可重复使用,但结合不牢固、 稳定性较差,需加入保护剂进行保护。 该试剂盒具有工作范围宽,灵敏度高的特点。据报道6,应用灵敏、 可靠的A FP测定方法 不仅可以对肝癌进行早期诊断,而且还可以研究各种类型急、 慢性肝炎和肝硬化时A FP的变 化。 因此该试剂盒在肝炎与肝癌的鉴别和高发区高危人群的监测,特别是肝癌的普查方面有较 大的应用价值。致谢:感谢王晶晶、 马京民、 于 洁等同志对本工作的大力支持。参 考 文 献 1 中华人民共和国卫生部 119781990中国卫生统计资料汇编 1 2
