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1、Species Delimitation and Historical Biogeography in the Genus Helice (Brachyura: Varunidae) in the Northwestern PacificWei Yin, Cuizhang Fu*, Li Guo, Qixin He, Jun Li, Binsong Jin, Qianhong Wu and Bo Li西北太平洋厚蟹属的物种界定和生物地理研究ZOOLOGICAL SCIENCE 26: 467475 (2009)报 告 人： 胡志勇 指导教师：傅萃长 副教授作者介绍作者介绍通讯作者：傅萃长 博士
2、研究生 复旦大学 研究方向：生物地理学，鱼类进 化 副教授 复旦大学 主要研究方向：生态与历史生物地理；亲缘动物地理学；鱼类的系统发育与进化；河口的鱼类生态学与渔业第一作者：殷维Contents研究背景1目的内容2材料方法3研究结果4讨论5重要名词解释Pliocene：上新世，属于新生代第三纪后期，上新世猿人下树进 入平地Pleistocene：更新世，属于新生代第四纪早期，更新世人类开 始出现junior synonyms：后来命名的同物异名种，一般不被采用analysis of molecular variance (AMOVA)：分子方差分析指通 过估计单倍型(含等位基因) 或基因型之间
3、的进化距离,进行遗传 变异的等级剖分，巧妙的避开了分子差异不便于计算的难题Haplotyple：是单倍体基因型的简称，在遗传学上是指在同一染 色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合研究背景厚蟹属Helice1. 厚蟹隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、方蟹科2. 厚蟹种类：台湾厚蟹H. formosensis; 侧足厚蟹H. latimera; 天津厚蟹H. tientsinensis; 三齿厚蟹H. Tridens共四种2. 厚蟹分布：西北太平洋大陆和岛屿海岸线潮间带的较高区域From baiduYin et al.研究背景西北太平洋独特的地理特征1. 邻接着众多的边缘浅海，有日本海、
4、黄海、东中国海、南中国海西北太平洋在末次盛冰期时的海岸线(Ota, 1998) 引自陈卉上新世和更新 世冰期交替海平面的升降海面轮廓改变影响物种的 形成隔离和 二次接触作用过程研究背景此前的研究影响近海鱼类种群空间 结构(Liu et al., 2006, 2007)影响海洋产卵蟹类的物 种形成和种群空间结构 (Wang et al., 2008)影响潮间带螺类和近海 鱼类的系统地理分布 (Kojima et al., 2003, 2004, 2006; Liu et al., 2008)鱼类蟹类螺类鱼类上新世和更新 世冰期交替西北太平洋洋流研究背景此前的研究1. Shih and Suzuk
5、i (2008) 分析了厚蟹线粒体16S RNA 和COI基因，认为H. latimera, H. formosensis和H. tientsinensis组成了一个有待解决的复合分支H. latimera clade，由此推测厚蟹可能只由两个种组成H. latimera 和H. Tridens研究背景Shih and Suzuki的研究存在的不足1. 使用的分子标记少，仅有16S RNA 和COI基因2. 研究的地理区域相对较小3. 形态学没有佐证Shih提出的H. formosensis和H. Tientsinensis是H. latimera同物异名种(他们眼框下的齿堤数有显著差异)4.
6、 没有给出明确的种的分界标准研究目的本研究拟解决的问题1. 扩大研究的范围使用更多分子标记探究厚蟹属内物种的个数，建立种与种之间的形态学分类标准2. 研究厚蟹属的历史生物地理学 ，分析厚蟹属的物种形成机制材料方法 厚蟹的采集1. 共17个样点2. 共采集123个样本,42 H. formosensis 37 H. latimera 42 H. tientsinensis 1 Helicana wuana 1 Chasmagnathus convexus 材料方法DNA的提取,扩增,测序1. 采用酚氯仿法从蟹的腿部肌肉提取总DNA(Palumbi, 1996)2. PCR扩增以下片段：12S r
7、RNA, 16S rRNA, COI, ITS-2和 28S rRNA3. 1.52.0%的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物4. 使用与PCR相同的引物做测序 实验内容系统发育树的构建第一步：序列排序和视觉检查 (Clustal X 1.83 (Thompson et al., 1997)第二步：选择数集和拆分序列：以(12S+16S+COI)基因为数 据集构建系统树，首先划数集为五部分12S, 16S, 和3个 COI编码区, 每一部分在MrModel test version 2.2 (Nylander, 2004)中选择一 个独立替代模型第三步：以每百代取样频率在MrBayes versio
8、n 3.1.1中运行九百万代 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003)第四步：丢弃前三分之一部分，余下部分用于构建系统树实验内容单倍型网络图的构建第一步：单倍型的鉴别使用软件DnaSP 4.20 (Rozas et al., 2003)第二步：在95%的隔离置信区间下，用简约法statistical parsimony algorithm (Templeton et al., 1992)在软件TCS 1.18中构建单倍型网络图 (Clement et al., 2000).实验内容种间遗传差异分析第一部分：用配对P距离描述配对的物种间12S, 16S, COI, and
9、 ITS-2单倍型的差异MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004)第二部分：用线粒体(12S+16S+COI)数据集和ITS-2基因在 软件ARLEQUIN version 3.11 (Excoffier et al., 2005)中做分子生物学方差分析 (AMOVA)实验内容基因流和分化时间基因流：使用隔离迁徙模型isolation-with-migration (IM) (Hey and Nielsen, 2004; Hey, 2005)计算H. formosensis, H. latimera和H. Tientsinensis 之间的基因流分化时间：H. formosen
10、sis, H. latimera, 和 H. tientsinensis 之间分化时间的计算利用COI核16S基因数据在IM模型下得到 。 以16S每百万年变异率0.880.035% , COI每百万年变异率2.330.95% (Schubart et al. 1998)为标准 在MEGA中计算H. tridens 和 H. formosensis-latimera- tientsinensis复合体间净平均种群间遗传距离实验内容形态上的分析依据眼下方齿数和肝侧下脊线齿数做如下三种统计分析双因子方差 分析三 种 分 析相异性分析聚类分析数据转换，对数化，做二维矩阵图利用相异系数矩阵分析配对个体
11、间差异， 在聚类分析中生成反应形态差异的聚类图以P值作为显著性指标，分析物种间和雌 雄间齿数差异是否达到显著研究结果序列差异12S rRNA gene： 862个核苷酸位点中有59个变异位点17个简约信息位点。54条序列中有19 个单倍型，种间共有单倍型极少16S rRNA gene： 513个核苷酸位点中有54个变异位点34个简约信息位点。57条序列中有10 个单倍型， H1, H4, 和H5是公共单倍型COI gene： 618个核苷酸位点中有184个变异位点107个简约信息位点。57条序列中 有16个单倍型，H1, H4,和H5是公共单倍型ITS-2 locus： 593个核苷酸位点中有
12、57个变异位点18个简约信息位点。36条序列中有5 个单倍型28S rRNA gene：8条序列中只有一个单倍型研究结果单倍型树1. 单倍型贝叶斯树清晰的显示了H. tridens和 H. formosensis-latimera- tientsinensis复合体间具有显著差异 2. 复合体内部中间单倍体树差异不显著研究结果单倍型网路图1. 单倍型网络图显示了H. tridens和H. formosensis-latimera-tientsinensis复合体间具有显著差异2. 单倍型网络图表明H. formosensis-latimera-tientsinensis复合体间遗传差异显著，且
13、有不完全的血统分类3.H. formosensis, H. latimera和H. tientsinensis之间浅的线粒体基因分化，表明以上三物种近期才发生物种分化研究结果基因流和分化时间1. 分子方差分析( ST=0.456, P0.001)和成对值 ST显示出三物种间(H. formosensis, H. latimera,和H. tientsinensis)除了ITS-2基因( ST=0.054, P=0.085)外显著的基因分化基因分化基因流 1.H. formosensis vs H. tientsinensis和H. latimera vs H. Tientsinensis 之间
14、的基因流极小(0.06-0.85)可忽略不计. 在H. formosensis和H. latimera间观察到不对称基因流，从H. formosensis到H. Latimera为 15.41迁移率每代,反向为值0.07研究结果基因流和分化时间分化时间分离物种线粒体COI基因分化率 计算的分化时间16S核糖体基因计算的分 化时间H. tridensVS 三复合种 突变率2.330.95%/Ma突变率0.880.035%/Ma1.920.42Ma1.420.50 Ma formosensis vs H. latimera 突变率1.17108 突变率0.44108 51 ka120 kaH. f
15、ormosensis vs H. tientsinensis 62 ka 730 kaH. latimera vs H. tientsinensis40 ka 22 ka研究结果形态上的差异两位置的齿堤数在种间水平上均表现出显著差异， 眼下齿堤数在性别间表现出显著差异研究结果形态上的差异1. 散点图中各物种以 齿堤描述的散点不 重叠，可见物种间 两类齿堤差异显著研究结果形态上的差异基于相异系数矩阵原理 ，以两类齿堤数作聚类 分析显示： 1.种内个体紧密聚在 一起 2.形态差异显著，种 间间距明显 3.建议用齿堤数作形 态鉴定特征讨论1. 贝叶斯树，单倍体网络图分析表明H. tridens和 H
16、.formosensis-latimera-tientsinensis complex具有明显 的血系分化。配对的P距离显示他们间的差异在属内水平 (1.181.96% 和 4.025.02% for 16S 和 COI)2. 线粒体基因显示H. formosensis, H. latimera和H. tientsinensis间具有清晰的血系分化，但ITS-2基因分化不 显著，因此他们的血系分化尚不完整3. 物种间微弱的基因流加上形态学上两类差异明显的齿堤数， 我们认为以上三个厚蟹属物种为有效种，而非同物异名种讨论厚蟹的历史生物地理学1. H. tridens分布于日本，H. formosensis-latimera- tientsinensis分布中国韩国大陆的边缘海域以及冲绳和台湾 。对马海峡(1.521.71 Ma)将日本与欧亚大陆隔开，由此为 H. tridens的形成(1.421.9
