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1、中华妇产科杂志 2 0 1 2年 3月第 4 7卷第 3期C h i n J O b s t e t G y n e c o l ， Ma r c h 2 0 1 2 ，V o 1 4 7 ，N o 3 阴道上皮细胞转染抗菌肽 L L 一 3 7和防御素 5 后对假丝酵母菌 的抑制作用 王芳孙蓓李红尹利荣 【 摘要】 目的研究人阴道上皮细胞转染抗菌肽 L L 一 3 7和防御素5 ( H D 5 ) 真核重组质粒后对假 丝酵母菌的抑制作用及其分泌白细胞介素 8 ( I L 8 ) 水平的变化。方法原代培养阴道上皮细胞并传 代后 ， 分为无菌组和带菌组 ， 每组内再分别转染 L L 一 3 7质
2、粒 p c D N A 3 1 (+) L L - 3 7 一 E G F P、 HD 5质粒 p c D N A 3 1 (+) HD 5 一 E G F P及联合转染两种质粒， 并设未转染质粒的阴道上皮细胞为对照； 带菌组均 与假丝酵母菌共培养。于6 、 1 2 、 2 4 、 4 8 h分别收集培养上清液 ， E L I S A方法检测 L L 一 3 7 、 HD 5及 I L 一 8的 水平； 采用葡萄糖消耗法检测各组细胞对假丝酵母菌的抑菌效果( 以吸光度值表示) 。结果( 1 ) 各 时段检测结果显示， 转染质粒的各组细胞分泌 L L 3 7、 H D 5 、 I L 一 8的水平
3、在转染 2 4 h时达高峰， 然后呈 下降趋势 ， 其中带菌组中联合转染细胞分泌 I J I 3 7、 H D 5 、 I L 一 8的水平均高于其他细胞， 峰值分别为 ( 1 0 0 1 6 4 - 0 8 1 )n g ml 、 ( 5 8 5 0 4-2 0 8 ) g m l 和( 1 0 1 0 31 5 9 )p g m l ， 差异均有统计学意义( P 0 0 5 ) ， 吸光度值呈缓慢下降趋势， 其 中， 联合转染细胞 6 、 1 2 、 2 4 、 4 8 h的吸光度值分别为 3 6 1 0 0 0 1 0 、 3 5 9 0 0 0 1 0 、 3 5 6 0 0 0 1
4、0、 3 5 3 0 0 0 1 0 ( P0 0 5 ) ； 带菌组 中联合转染细胞吸光度值 6 、 1 2 、 2 4、 4 8 h分别为 3 2 1 00 0 1 0 、 3 1 5 0 0 0 3 0 、 3 0 9 90 0 3 0、 2 9 7 0 0 0 4 0 ， 明显高于组内其他细 胞， 差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ， a s w h i l e a s i n L L 一 3 7 s u b g r o u p a n d HD 5 s u b g r o u p w i t h C a n d i d a a l b i c a n s I n g r o u
5、 p w i t h C a n d i d a a l b i c a n s ， t h e a b s o r b a n c e o f c o mb i n i n g t r a n s f e r r i n g s u b g r o u p we r e 3 2 1 0 0 0 1 03 1 5 0 0 0 3 03 0 9 9 0 0 3 0 a n d 2 9 7 00 0 4 0 a t 6，1 2，2 4 a n d 4 8 h o u r s ，r e s p e c t i v e l y ，w h i c h wa s s i g n i fi c a n t
6、l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e o t h e r c e l l s f P 0 0 5 ) ， A值呈缓 慢下降趋势； 带菌组中各亚组各时段组内4值两两 比较 ， 差异均有统计学意义( P 0 0 1 ) ， A值呈 明显 下降趋势 ， 但联合转染亚组 4值下降趋势较未转染 亚组 、 L L - 3 7亚组和 HD 5亚组缓慢 。组间和处理时 间之间存在交互效应 ( F夺 百=1 9 9 3 4 5 5， P 0 0 1 ) 。 见表 3 。 三 、 阴道上皮细胞转染后 I L 8的分泌水平 同一时段各组亚组间 I L - 8水平差异
7、有统计学 意义 ( F 组 闻= 6 0 1 7 5 ， P0 0 1 ) ； 无 菌组及带菌组 中 联合转染亚组高于 L L 3 7亚组 、 HD 5亚组 ， L L 3 7亚 组 、 H D 5亚组 高于未转染亚组 ， 差异均有统计 学意 义( P 0 0 1 ) 。带菌组 中各个亚组 I L 一 8的分泌水平 均高于无菌组中相对应各亚组 ， 差 异有统计学意义 ( P 0 0 1 ) 。组 内不同时间 I L 8水平差异均有统计 学意义( F 时 间=1 0 4 3 0 6 6 ， P 0 0 1 ) ， 在 6 h时最低 ， 2 4 h达 高峰 ， 然后呈下降趋势 ； 无 菌组 阴道上
8、 皮细 胞分泌 I L 8处于低水平稳定状态 ， 联合转染质粒后 可使 I L 8分泌水平 增加。组 间和处理 时间之间存 在交互效应( F 交 互=3 7 1 7 8 6 2 ， P 0 0 1 ) 。见表 4 。 讨 论 一、抗菌肽在 V V C阴道局部免疫中的作用 女性下生殖道为开放性腔道 ， 正常情况下是以 乳杆菌等优势菌为主要组成 的微生态系统 ， 当受到 内源性和外源性因素影响时 ， 很容易发生改变 ， 导致 疾病的发生 j 。V V C主要 由白假丝酵母菌引起 ， 此 菌为条件致病菌 ， 其致 病性与宿主的免疫状态关 系 密切 ， 对假丝酵母菌感染的防御机制 目前 尚不十分 清楚
9、 。多数研究认 为， 是阴道局部而不是全身性 细 胞免疫在宿主的抗感染 机制 中发挥重要的作用 ， 所 以阴道黏膜固有的免疫机制已受到学者的关注。 研究发现 ， 人体基 因组中存在近千种 编码具有 抗生素样活性蛋 白的基 因 J ， 这些基 因编码的短肽 富含带 阳离 子 的氨 基 酸残 基 ， 称 之 为 “ 肽 抗 生 素 ( p e p t i d e a n t i b i o t i c s ) ”或 “抗 菌 肽 ( a n t i m i c r o b i a l p e p t i d e ) ” 。抗菌肽可 以直接 消灭 病原体并 且可 调 表3 各组阴道上皮细胞不同时段的
10、A值比较( 面- 1- s ) 表4 不同组阴道上皮细胞不同时段 I L 一 8的分泌水平( p g m l ， x s ) 中华妇产科杂志 2 0 1 2年 3月第 4 7卷第 3期C h i n J O b s t e t G y n e c o 1 Ma r c h 2 0 1 2 V o 1 4 7 N o 3 节宿主免疫和其他生物学反应 J 。女性 阴道 中抗 菌肽的存在及其对抗假丝酵母菌的作用 已被许多研 究所证实。在体外实验中发现， 阴道黏膜上皮细胞 对假丝酵母菌有一定的自然抵抗性 J ， 在假丝酵母 菌刺激下其会分泌具有杀伤作用 的抗菌肽 ， 同时促 进局部特异性细胞免疫的建立
11、 。抗菌肽分泌量的增 加对杀灭假丝酵母菌起到重要作用 ， 也是防止 V V C 反复发作的有利保障。防御素家族中 HD 5除了在 肠道黏膜表达以外主要在女性生殖道的复层上皮细 胞表达 ， 包括 阴道 、 宫颈 、 子宫内膜和输卵管 ， 在胎盘 和胎膜 中也证实有 H D 5的存在。人源 阳离子抗菌 肽 1 8( h C A P 1 8) 是 存 在 于 人 体 的 一 种 抗 菌肽 ， h C A P 1 8是前体形式 ， 而 L L 3 7则是有活性 的成熟 形式 J 。这两种抗菌肽对假丝酵母 菌都有较强 的 杀灭作用 ， 并且在阴道上皮细胞中表达量高， 故本研 究以这两种抗菌肽为研究对象
12、， 在前期实验中也证 实 ， V V C患者阴道冲洗液中 HD 5及 L L 3 7的含量均 有升高， 但在复发性 V V C患者阴道冲洗液 中的含量 却呈下降趋势 ， 证明抗菌肽 的表达下降可能与 V V C 的反复发作有关 。 二、 阴道上皮细胞转染 HD 5 、 L L 一 3 7真核重组质 粒后 HD 5 、 L L 一 3 7的分泌情况 本研究原代培养 的阴道上皮细胞稳定传代至第 4代后 ， 将人工合成 的带荧 光蛋 白的真核重组质粒 p c D N A 3 1 (+) HD 5 一 E G F P和 p c D N A 3 1 (+) L L - 3 7 一 E G F P转染细胞
13、 ， 结果证实， 体外培养 的阴道上皮 细胞 经 转染 质 粒 p c D N A 3 1 (+) L L 3 7 - E G F P或 ( 和) p c D N A 3 1 (+) H D 5 E G F P后 ， 分泌 L L 一 3 7及 H D 5的水平较未转染 者明显增加。这种增加趋 势 在带菌组 中更加 明显 ， 其 中联 合转染 细胞 分泌 的 L L 一 3 7 、 H D 5水平最高， 说 明阴道上皮细胞 自身有一 定水平的抗菌肽分泌， 但这种分泌是一种持续 的低 水平稳定状态， 假丝酵母 菌的存在能促进 阴道上皮 细胞抗菌肽的分泌 ， 而转染质粒后 L L 3 7 、 H
14、D 5分泌 水平明显增加 ， 其 中带菌组的联合转染亚组分泌水 平在各时段均为最高值 ， 峰值出现在转染后 2 4 h ， 说 明转染 2 4 h时 HD 5和 L L 3 7分泌水平最高。这与 K i e h n e 等 _ 9 的研究结果一致 ， 即防御素表达的增加 可 以有效地抵御假丝酵母菌的侵袭， 同时将感染限 制在上皮的表层 。本研究证实 ， 阴道上皮 细胞对假 丝酵母菌有天然的抵抗作用 ， 但 自然状态下抗菌肽 的分泌量有限 ， 感染后抗菌肽的分泌量会增加 ， 但增 加的量不足以抵抗假丝酵母菌对上皮细胞 的侵袭 ， 阴道微生态平衡被破坏 ， 对一些抗假丝酵母菌药物 产生耐药 ， 则
15、 出现反复感染及难治性 V V C 。 三、 阴道上皮细胞转染 H D 5 、 L L 3 7重组质粒后 对假丝酵母菌的抑制作用 抗菌肽抗假丝酵母菌的机制主要是在真菌细胞 膜上形成离子通道 ， 破坏胞膜 的完整性造成细胞死 亡。本研究利用葡萄糖消耗法检测阴道上皮细胞对 假丝酵母菌的抑制效果， 在葡萄糖低浓度时， 假丝酵 母菌必须消耗能量以主动运输方式来转运葡萄糖进 入细菌胞体 内， 由于 HD 5及 L L 一 3 7对其 的抑制和消 灭 ， 假丝酵母菌细胞能量代谢水平低下 ， 无法摄取足 够的葡萄糖。葡萄糖消耗百分率与假丝酵母菌细胞 受抑制程度呈反比， 通过 比较不 同细胞不同时段培 养上清液 中的A值反 映葡萄糖 的剩余量 ， 以数值形 式客观地反映假丝酵母菌的代谢水平 ， 进而 比较阴 道上皮细胞的抑菌效果。 本研究不 同时段带菌组中联合转染亚组抑菌效 果 ( A值 ) 明显高于其他各亚组 ， 随时间延长带菌组 中各亚组 值均呈下降趋势 ， 假丝酵母菌消耗的葡 萄糖量逐渐增多 ， 但联合转染亚组 A值下降趋势较 转染一种质粒或未转染质粒的亚组缓慢 ， 说 明联合 转染质粒后 由于 L L - 3 7及 H D 5分泌量
