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1、四环素对兔动脉粥样硬化斑块的影响摘要目的探讨四环素对兔动脉粥样硬化组织中基质金属蛋白 酶- 2 ( M a t r i xM e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 , M M P - 2 )活性和表达的 影响;同时探讨四环素对动脉粥样硬化斑块稳定性和动脉粥样硬化血管重构的影响。方法3 0只雄性新西兰白兔随机分为 3组，正常组 ( n = 1 0 )给予一般饲料喂养; 模型组 ( n = 1 0 ) 喂高脂饲料 ( 胆固 醇1 . 鲍. d -. 只一， ， 猪油5 . 摊. d -. 只一， ) ;四 环素组 ( n = 1 0 ) 喂高脂饲料 ( 同 前)
2、，同时 加喂四环素 2 5 0 m g . d - . 只一 ，。饲养1 2 w 处死，将取出的降主动脉分成两份，一份置于 1 0 % 的中性福尔马林固定液中固定，通过 H E 常规染色，M a s s o n s染色进行病理形态学观察，以及 M M P - 2免疫组化检查。另一份于 1 0 m i n内置于液氮中保存，同时用酶谱法 ( S D S - P A G E电泳)测定 M M P - 2酶活性。采用 M i v n t图像分析软件对病理图像和电泳凝胶消化条带结果进行分析。结果模型 组和四环素组内膜厚度较正常组有明显差异( P D Y Y - 8 B 型稳压稳流电泳仪和D Y C Z
3、- 2 1 型电泳槽( 北京市六一仪器厂) ，D M 4 0 0 0 B L e i c a 显微摄像仪 ( 德国莱卡公 司) ， M i v n t 显微图 像分析软件， O l y m p a sA U l 0 0 0 全自 动生物化学分析仪。3 .实验方法3 . 1 兔动脉粥 样硬化模型的 建立3 0 只雄性新西兰家兔，体重2 . 0 - 2 . 5 k g / 只，由昆 明医学院实 验动物中 心提供， 随机分为正 常组 ( n = 1 0 ) 、 模型组 n = 1 0 ) 及四 环素组 ( n = 1 0 ) 。 正 常组 喂一般饲料; 模型组 喂高脂饲料 ( 胆固醇1 . 摊. d
4、 . 只一，猪油5 . O g . d “ . 只一， ) ;四环素组 喂高脂饲料 ( 同 前) ，同 时加喂四 环素2 5 0 m g . d - . 只一 ，。 饲养 1 2 w处 死，取出降主动脉分成两份， 一份置于 1 0 % 中性福尔马林固定液中，固定 2 4 h后常规石蜡包埋;另一份在 1 0 m i n内置于液氮中保存。3 . 2 体重和血脂四 项的测定于实验前、 实验 6 w 及处死前分别测动物体重， 分别于实验 。 w , 4 w , 8 w 及1 2 w ，经兔耳中央动脉空腹采血 5 m l ， 在日本 O l y m p a s A U 1 0 0 0全自动生物化学分析仪
5、上测定血脂四项， 血清总胆固醇 ( T O 和甘油三脂 T G )采用酶法测定;高密度脂蛋白胆固醇 ( H D L C )和低密度脂蛋 白胆固醇( L D L C ) 采用一步法，试剂为美国R a n d o x公司产品。3 . 3 酶 谱 法 ( Z e m o g r a p h y ) 测 定 动 脉 组 织 基 质 金 属蛋 白 酶 - 2 活 性 w称取 0 . 5 g液氮冻存的动脉标本，加入提取液 0 . 5 m l 4 下匀浆、离心( T r i s - H C 1 0 . l m o l / L , P H 7 . 6 , N a C l 2 0 m m o l / L , C
6、 a C 1 z 1 0 m m o l / L , 0 . 0 1 % T r i t o n X - 1 0 0 l m l ) ，取上清液分装，用酚试剂改良 法测定蛋白浓度。用 S D S - P A G E电泳方法测定动脉组织 基质金属蛋白酶 - 2 活性。 按文 献方法u 1 ， 制作含0 . 0 1 % 明胶的分离胶， 作为明胶酶的分 解底物，向 提取液中 加入缓冲液 ( 0 . 2 5 m o l / L T r i s - H C I , 1 0 % S D S , 4 % 糖，0 . 1 % 澳酚 蓝， P H 6 . 8 ) 混合， 立即点样于浓缩胶， 同时加蛋白质 M a
7、 k e r ， 在 4 和 1 2 0 v ,2 0 m A的电流条件下电泳 6 h ;剪下 M a k e r ，将分离胶剥离并浸泡在洗脱液中( 2 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 , T r i s - H C 1 5 0 m m o l / L , C a C l z 5 m m o l / L , Z n C l z l u m o l / L P H 7 . 6 )， 室温下摇荡 9 0 m i n ， 换洗脱液一次，再摇荡 4 0 m i n ， 将分离胶置于反应液中 ( T r i s - H C I5 0 m m o l / L , C a C l z
8、 1 0 m m o l / L , Z n C l z 1 u m o l / L , N a C l 5 0 m m o l / L ， P H 7 . 6 )， 3 7 下孵育 4 2 h ;取出胶， 用 0 . 0 5 % 考马斯亮蓝 R - 2 5 0 染色 3 h ， 然后用脱色液 ( 3 0 % 甲 醇， 1 0 % 乙酸)洗脱至背景清晰。 用 M i v n t图像分析软件分析实 验结果。所得正常组、 模型组及四环素组蛋白质分子量为 6 2 k D 的电泳条带面积与条带灰度值，结合蛋白质含量计算出比活性，即比活性=( 条带面积x条带灰度值)/ 蛋白质含量。3 . 4 动脉粥样硬
9、化的检 测和斑块稳定性 评估在麻醉状态下 剖开胸 腔， 用生理盐水置换出 动脉血， 以 1 0 % 中 性福尔马林( 配方: 甲 醛 1 0 0 m l ， 无 水磷酸 二氢钠 6 . 5 g ,磷酸二氢钠 4 . O g , 蒸馏水 9 0 0 m 1 ) 恒压灌注胸降主动脉 1 5 m i n ， 分离胸降主动脉， 去除外膜脂肪组织， 取出实验白兔降主动脉，用 1 0 % 的中性福尔马林固定 2 4 h ，常规石蜡包埋、切片 ( 厚 4 “ 5 1 1 m ) ，行M a s s o n s 三色染色和 H E染色。应用计算机 M i v n t显微图像分析软件分别测出动脉中层厚度、内膜厚
10、度、内膜面积、中层面积、粥样硬化斑块中纤维帽厚度、脂质池厚度、纤维帽面积及脂质池面积，分别计算内膜厚度/ 中层厚度， 斑块中纤维帽厚度/ 脂质池厚度及脂质池面积/ 纤维帽面积的值。取2 0 次测量平均值为测量值，以内弹力板包绕面积减去管 腔面积为内 膜面积，以 外弹力板包绕面积减去内弹力板包绕面积为中层面积，每只白兔以连续 3张切片计算的平均值为统计资料。 通过中层厚度、内 膜厚度、内 膜与中 层厚 度的比值，以 及内 膜面积与中层面积的比值， 来评价动脉粥样硬化的严重程度;通过斑块中纤维帽厚度、脂 质池厚 度、纤维帽厚度与 脂质池厚度的比 值以 及脂质池面积与纤维帽面积的比值，来评价动脉粥样
11、硬化斑块的稳定性。3 . 5 免疫组织化学法动脉标 本的制作方法同上， 应用免疫组织化学S P 法检测兔动脉组织中M M P - 2的表达， M M P - 2多克隆抗体由武汉博士德生物技术有限公司提供，以磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照，阳性切片由武汉博士德生物技术有限公司提供， 具体步骤参照试剂 盒说明书:常规石蜡切片， 厚度为 4 - 5 v m ; 用 二甲 基苯和梯度酒精脱蜡至水后，用 O . O l m m o l / L ( P H 结果有显著差异。实 验 结 果、血脂和体重高脂饲养 4 w , 8 w 及 1 2 w 后，模型组和四环素组 T G , T C , L D L C
12、及H D L Co w 显著升高 ( P 0 . 0 5 )见表 1 o结论1 .本实验成功地建立了白兔动脉粥样硬化模型， 为以 后成功建立动物动脉粥样硬化模型积累了经验.2 ，动脉粥 样硬化组织中M M P - 2 酶活性和表达升高， 提示M M P - 2 可能与动脉粥样硬化的形成和发展有关。3 四 环素能明显抑制动脉粥样硬化组织中M M P -2 酶的 活性和表达.4 .四环素增加 动脉粥样硬化斑块纤维帽厚度与脂质池厚度的比 值， 对稳定粥样硬化斑块，防止 A C S的发生可能具有重要的作用。5 .四 环素增加中层厚度与内 膜厚度的比 值， 抑制动脉粥 样硬化中 的血管重构， 延缓动脉粥
13、样硬化发展。参 考 文 献1 . W o e s s n e r J F . M a t r i x m e n t a l l o p r o t e i n a s e a n d t h e i r i n h i b i t o r s i nc o n n e c t i v e t i s s u e r e m o d e l i n g . F A S E B J , 1 9 9 1 , 5 ( 8 ) : 2 1 4 5 - 2 1 5 4 .2 . K l e i n e r D E , S t e t l e r - S t e v e n s o n W G . . Q
14、 u a n t i t a t i v ez y m o g r a p h y : d e t e c t i o n o f p i c g r a m q u a n t i t i e s o f g e l a t i n a s e s . A n a l y t i c a lb i o c h e m i s t r y , 1 9 9 4 , 2 1 8 : 3 2 5 - 3 3 2 .3 . G a l i s Z S , S u k h o v a G K , L a r k M W , e t a l . I n c r e a s d e x p r e s s
15、i o n o fm a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s a n d m a t r i x d e g r a d i n g a c t i v i t y i n v u l n e r a b l er e g i o n s o f h u m a n a t h e r o s c l e r o t i c p l a q u e s . J C l i nI n v e s t , 1 9 9 4 , 9 4 (6 ) : 2 4 9 3 - 2 5 0 3 .4 . M a s o n D P , K e n a g y
16、 R D , H as e n s t a b D ,e t a l . M a tr ix m e t a llo p r o te in as e - 9o v e r e x p r e s s i o n e n h a n c e s v as c u la r s m o o t h m u s c le c e ll mig r a ti o n a n d a lt e r sr e mo d e li n g in th e in j u r e d r a t c a r o ti d a r te r y . C ir c R e s . 1 9 9 9 ; 8 5 : 1 1 7 9 - 1 1 8 5 .5 . A m o r in o G P , H o o v e r R L . In t e r a c ti o n s o f m o n o c y tic c e lls w i th
