乙脑病毒检验和研究最新进展

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1、乙脑病毒检验和研究最新进展乙脑病毒检验和研究最新进展2009.11.42009.11.4 乙脑实验室检测乙脑实验室检测乙脑实验室检测乙脑实验室检测 ELISA ELISA IgMIgM IFAIFA 病毒分离病毒分离 微量中和试验微量中和试验 PCRPCR 研究现况研究现况研究现况研究现况 商品化商品化ELISA JE ELISA JE IgMIgM检测试剂盒研发检测试剂盒研发 利用人体组织标本分离乙脑病毒利用人体组织标本分离乙脑病毒 从蚊虫标本分离虫媒病毒并鉴定毒株从蚊虫标本分离虫媒病毒并鉴定毒株 利用非传统媒介分离虫媒病毒并鉴定毒株利用非传统媒介分离虫媒病毒并鉴定毒株 利用分子生物学方法进

2、行同源性分析、毒力分析等利用分子生物学方法进行同源性分析、毒力分析等 病毒性脑炎病毒性脑炎乙脑实验室检测乙脑实验室检测 ELISA ELISA IgMIgM乙脑实验室工作流程乙脑实验室工作流程乙脑实验室检测乙脑实验室检测 ELISA ELISA IgMIgM病例实验室检测流程病例实验室检测流程 0909年以前年以前 急性期血、脑脊液急性期血、脑脊液 、（恢复期血）、（恢复期血） JEJE IgMIgM、JEJE IgGIgG0909年要求年要求 急性期血、脑脊液、（恢复期血）急性期血、脑脊液、（恢复期血） JEJE IgMIgM 恢复期血清恢复期血清JE IgMJE IgM（- -） 疑似病例

3、疑似病例20102010年年 急性期血、脑脊液、（恢复期血）急性期血、脑脊液、（恢复期血） JE IgMJE IgM 恢复期血清恢复期血清JE IgMJE IgM（- -）排除）排除乙脑实验室检测乙脑实验室检测 ELISA ELISA IgMIgM 病例实验室检测流程病例实验室检测流程乙脑实验室检测乙脑实验室检测 ELISA ELISA IgMIgM目前采用试剂盒：上海贝西目前采用试剂盒：上海贝西 实验原理：捕获法实验原理：捕获法ELISAELISA操作步骤：详见说明书操作步骤：详见说明书乙脑实验室检测乙脑实验室检测 ELISA IgMELISA IgM对现采用上海贝西对现采用上海贝西JE I

4、gMJE IgM检测试剂盒的要求检测试剂盒的要求 酶标二抗稀释后最好在酶标二抗稀释后最好在7 7天内使用；天内使用； 根据根据ODOD值判断试验结果；值判断试验结果； 结果判断：样品结果判断：样品ODOD值压在临界值上的，建议值压在临界值上的，建议 二次检测，结果报低不报高；二次检测，结果报低不报高； 保存书面资料，便于日后翻阅。保存书面资料，便于日后翻阅。乙脑实验室检测乙脑实验室检测 IFAIFA原理原理乙脑实验室检测乙脑实验室检测 IFAIFAP + +N +/-B -结果判断结果判断（判断检测系统成立与否判断检测系统成立与否） 阳性对照荧光强度在阳性对照荧光强度在“+”以上以上； 阴性对

5、照最好为阴性对照最好为“-”，也可以为也可以为“+/-”； 空白对照为空白对照为“-”乙脑实验室检测乙脑实验室检测 IFAIFA+ 结果判断结果判断 观察细胞的荧光强度观察细胞的荧光强度，结合其在整个孔内的分布结合其在整个孔内的分布，作作 出荧光强度的等级判断出荧光强度的等级判断； -：无荧光无荧光；+/-:极弱的可疑荧光极弱的可疑荧光 +：荧光较弱荧光较弱，但清晰可见但清晰可见+：荧光明亮荧光明亮 + +：荧光闪亮荧光闪亮，且范围广泛且范围广泛；乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离 现阶段主要从蚊虫标本分离病毒现阶段主要从蚊虫标本分离病毒 标本保存条件标本保存条件 8080或者液氮

6、（或者液氮（196196） 生物安全要求生物安全要求 标本处理及实验流程标本处理及实验流程 细胞株及结果细胞株及结果乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离人员着装人员着装 帽子帽子口罩口罩防护服防护服橡胶手套橡胶手套个个 体体 防防 护护 装装 备备乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离实实 验验 室室 防防 护护 装装 备备生物安全柜生物安全柜紫外灯紫外灯酒精灯酒精灯乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离 一一、取出标本取出标本一一、取出标本取出标本液氮液氮乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离保持冰浴保持冰浴标本记录详细标本记录详细快速插入冰浴中快速插入冰浴

7、中乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离研磨器在冰浴中预研磨器在冰浴中预 冷冷5min5min，研磨时手研磨时手 持研磨器上持研磨器上1/31/3部部， 可以反复冰浴可以反复冰浴。乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离12341.1.取出研磨器和蚊虫标本取出研磨器和蚊虫标本2.2.拔出研磨杵拔出研磨杵3.3.将蚊虫倒入研磨器中将蚊虫倒入研磨器中4.4.加入加入1ml1ml研磨液研磨液乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离565.5.反复快速研磨反复快速研磨6.6.直至大的组织块消失直至大的组织块消失7.7.将研磨液吸出将研磨液吸出8.8.加入加入1.5ml EP1.5m

8、l EP管中管中78乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离1. 1. 将研磨液配平将研磨液配平2. 42. 4 12,000 rpm 12,000 rpm 离心离心20min20min1233.3.离心后的研磨液离心后的研磨液44.4.插入冰浴中插入冰浴中乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离1.1.吸出离心后的上清液吸出离心后的上清液2.2.加入弃去培养液的细胞管中加入弃去培养液的细胞管中3.3.感染后的细胞培养管感染后的细胞培养管4.4.孵育孵育1h1h1234乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离4.4.倒掉研磨液上清倒掉研磨液上清5.5.无血清培养基洗无血清培养

9、基洗1 1- -2 2次次6.6.加入维持液加入维持液7.7.培养培养，观察观察1 1周周1234乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离C6/36C6/36对照对照（60h60h）C6/36细胞病变细胞病变（60h60h）BHKBHK- -2121对照对照（60h60h）BHKBHK- -2121细胞病变细胞病变（60h60h）乙脑实验室检测乙脑实验室检测 病毒分离病毒分离乙脑实验室检测乙脑实验室检测 微量中和试验微量中和试验 人或动物感染病毒后人或动物感染病毒后，血清中可产生具有高度特异性的中血清中可产生具有高度特异性的中人或动物感染病毒后人或动物感染病毒后，血清中可产生具有高度特异

10、性的中血清中可产生具有高度特异性的中 和抗体和抗体；它可以使具有感染力的病毒失去感染性它可以使具有感染力的病毒失去感染性，保护机保护机和抗体和抗体；它可以使具有感染力的病毒失去感染性它可以使具有感染力的病毒失去感染性，保护机保护机 体免受病原的感染体免受病原的感染。体免受病原的感染体免受病原的感染。 中和试验是一种利用观察病毒感染力变化反映并检测中和中和试验是一种利用观察病毒感染力变化反映并检测中和中和试验是一种利用观察病毒感染力变化反映并检测中和中和试验是一种利用观察病毒感染力变化反映并检测中和 抗体水平的试验方法抗体水平的试验方法。抗体水平的试验方法抗体水平的试验方法。 将病毒与抗体作用将

11、病毒与抗体作用，然后接种组织细胞或动物来测定病毒然后接种组织细胞或动物来测定病毒将病毒与抗体作用将病毒与抗体作用，然后接种组织细胞或动物来测定病毒然后接种组织细胞或动物来测定病毒 感染力感染力。感染力感染力。 常用的病毒感染力的观察指标有细胞病变常用的病毒感染力的观察指标有细胞病变、蚀斑形成数以蚀斑形成数以常用的病毒感染力的观察指标有细胞病变常用的病毒感染力的观察指标有细胞病变、蚀斑形成数以蚀斑形成数以 及动物死亡等及动物死亡等。及动物死亡等及动物死亡等。 中和试验常用作病毒性疾病的诊断中和试验常用作病毒性疾病的诊断、疫苗免疫效果评价疫苗免疫效果评价、中和试验常用作病毒性疾病的诊断中和试验常用

12、作病毒性疾病的诊断、疫苗免疫效果评价疫苗免疫效果评价、 人群抗体水平调查人群抗体水平调查；亦可用已知的标准免疫血清或免疫腹亦可用已知的标准免疫血清或免疫腹人群抗体水平调查人群抗体水平调查；亦可用已知的标准免疫血清或免疫腹亦可用已知的标准免疫血清或免疫腹 水鉴定病毒水鉴定病毒。水鉴定病毒水鉴定病毒。 中和试验可以分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病中和试验可以分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病中和试验可以分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病中和试验可以分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病 毒法毒法。目前常用微量细胞培养板滴定目前常用微量细胞培养板滴定，简称微量细胞中和简称微量细胞中和毒

13、法毒法。目前常用微量细胞培养板滴定目前常用微量细胞培养板滴定，简称微量细胞中和简称微量细胞中和 试验试验。试验试验。乙脑实验室检测乙脑实验室检测 微量中和试验微量中和试验实验步骤实验步骤 1.TCID501.TCID50的测定的测定 2. 2.微量中和试验微量中和试验乙脑实验室检测乙脑实验室检测 微量中和试验微量中和试验TCID50TCID50的测定的测定 Tissue culture infective doseTissue culture infective dose 半数组织培养感染剂量半数组织培养感染剂量, ,又称又称50%50%组织细胞感染量组织细胞感染量指能在半数细胞培养板孔或试管

14、内引起细胞病变的指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变的 病病 毒量毒量乙脑实验室检测乙脑实验室检测 微量中和试验微量中和试验TCID50TCID50的测定的测定 1.BHK1.BHK- -2121细胞培养：细胞培养：9696孔板，孔板，100ul/100ul/孔，孔，3737 5%CO25%CO2培养箱培养培养箱培养36h36h； 2. 2.病毒稀释：新鲜病毒悬液病毒稀释：新鲜病毒悬液1010倍稀释，获得系列稀释倍稀释，获得系列稀释 度的病毒悬液（度的病毒悬液（1010- -1 1、1010- -2 2、1010- -3 3）；）； 3. 3.分别接种分别接种BHKBHK- -2121细

15、胞，每个稀释度接种细胞，每个稀释度接种4 4孔，孔，50ul/50ul/孔；同时孔；同时 设立正常细胞对照设立正常细胞对照4 4孔；孔； 3737 5%CO25%CO2培养箱孵育培养箱孵育1h1h； 4. 4.补加补加150ul150ul维持液，维持液， 3737 5%CO25%CO2培养箱培养数日；培养箱培养数日； 5. 5.逐日观察结果，逐日观察结果，3 3天后经计算得到天后经计算得到TCID50TCID50乙脑实验室检测乙脑实验室检测 微量中和试验微量中和试验0 04 44 4正常对照正常对照0 00/80/80 08 80 04 44 41010- -6 620%20%1/51/51 14 41 13 34 41010- -5 5 80%80%4/54/54 41 13 31 14 41010- -4 4100%100%8/88/88 80 04 40 04 41010- -3 3 100%100%12/1212/1212120 04 40 04 41010- -2 2100%100%16/1616/1616160 04 40 04 41010- -1 1有病变有病变 孔数孔数无病变无病变 孔数孔数病变率病变率病变孔病变孔 数比例数比例累计总数累计总数有病变有病变 孔数孔数无病变无病变 孔数孔数总接种总接种 孔数孔数病毒稀病毒稀