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1、上海交通大学硕士学位论文 2上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海交通大学硕士学位论文 3上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构
2、送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海交通大学硕士学位论文 4gpr128表达和定位研究及基因剔除打靶质粒构建 摘 要 G 蛋白偶联受体是最大的哺乳动物蛋白超家族之一， 其作用是将信号跨膜传递给 G 蛋白，作为信号传递者参与生理转化过程并可作为药物治疗靶点。受体分成五大家族：G
3、lumate, Rhodopsin,Adhesion,Frizzled/Taste 2 和 Secretin。小鼠gpr128 为Adhesion 家族成员，位于 16 qC1.1，长 71.664kb，包含 16 个外显子，开放阅读框为 2358bp，蛋白产物有 785 个氨基酸，包括长 N 末端, GPCR 蛋白水解位点(GPS)和七个跨膜区(7TM),与人类 GPR128 同源性达 69.9%。 半定量 RT-PCR 检测示gpr128 仅表达于肠道。通过对 0,1,2,4,8周小鼠的研究证实 gpr128表达不存在时相特异性。免疫组化实验表明gpr128 在小鼠肠粘膜上皮细胞表达。 将
4、成功克隆的gpr128全长 cDNA与pAcGFP1-N2载体相连并转染3T3细胞,真核表达载体形成的gpr128-EGFP 融合蛋白定位于细胞膜， 通过细胞实验验证了生物信息学分析结论。 由小鼠gpr128基因序列设计扩增同源臂：短臂长 2.9kb,长臂3.2kb。同源臂插入载体后方向与 PGK-neo 相反，预期以 PGK-neo 取代第 4 和第 5 外显子为主共 3479bp。打靶质粒的构建为基因剔除小鼠模型上海交通大学硕士学位论文 5的建立和基因功能的研究打下基础。 总之，通过基因表达分析gpr128主要表达在肠粘膜上皮细胞，蛋白定位于细胞膜。 在gpr128基因剔除打靶载体构建的基
5、础上有望进一步建立小鼠模型并通过表型分析研究基因功能和作用机制。 关键词：G 蛋白偶联受体, gpr128, 基因表达，亚细胞定位，基因剔除 上海交通大学硕士学位论文 6THE RESEARCH OF EXPRESSION AND LOCATION OF gpr128 AND THE CONSTRUCTION OF GENE KNOCKOUT PLASMID ABSTRACT The superfamily of G-protein coupled receptors (GPCRs) is one of the largest protein families of mammalian gen
6、omes.The role of GPCRs is to transducer a signal over the membrane to a G protein. They are signal mediators that have a prominent role in the regulation of physiological processes and they are the targets of numerous prescribed drugs which can be divided into 5 main families: Glumate, Rhodopsin,Adh
7、esion,Frizzled/Taste 2 and Secretin. The mouse gpr128 is one of the Adhesion family members which was mapped on 16 qC1.1 and spans about 71.664kb region. It contains 16 exons and ORF of 2358bp. The predicted protein is composed of 785 amino acids including long N-termini, GPCR proteolytic site(GPS)
8、and 上海交通大学硕士学位论文 7seven transmembrane(7TM) region, and shares 69.9% identity compared with human GPR128. Semi-quantitative RT-PCR analysis show that gpr128 was mainly expressed in small intestine, colon and rectum. Through the research of 0,1,2,4,8 week mouse, there is no heterochronic expression of
9、 gpr128.According to the experiment of immunohischemistry, gpr128 was expressed in the intestinal epithelial cells. With the help of computer assembly,PCR and sequencing,the cloning of full-length cDNA of gpr128 was finished with intact ORF.In order to investigate the subcellular location of gpr128,
10、the full-length of cDNA was inserted into the pAcGFP1-N2 vector to generate a fusion protein of gpr128 and EGFP. After the transfection of the eucaryotic expression vector into 3T3 cell, the gpr128 was verified to situate transmembranally in cells where it recognize its ligand. A fragment of genomic
11、 DNA which harbors part of gpr128 gene was obtained by screening the mouse genomic library. This fragment contains the exon 4 and exon 5 of gpr128.A targeting vector was constructed containing a 2.9kb short arm of homology and a 3.2kb 上海交通大学硕士学位论文 8long arm of homology flanking a PGK-neo cassette.Th
12、e PGK-neo cassette replaced a 3479bp region in reverse orientation to gpr128 transcription. Its helpful for the establishment of gene knockout mouse model and the research of the gene function. In conclusion, the expression pattern of gpr128 was created and gpr128 was expressed in the intestinal epi
13、thelium. It was located on the cell membrane. Based on the construction of gene knockout plasmid, the generation of gene knockout mouse model will be finished which will be a foundation for further research on the function and acting mechanism of gpr128. KEY WORDS: G-protein coupled receptors, gpr12
14、8, gene expression, subcellular location, gene knockout 上海交通大学硕士学位论文 12前言 G 蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPCRs）是最大的细胞表面受体超家族之一。 包括 800 多个人类基因， 占所有人类基因的 2%3%1。 GPCRs 长度可以从 300 个氨基酸到 1000 个氨基酸不等， 并有特征性的7个螺旋跨膜区seven -helical transmembrane (7TM) regions2。 超家族成员识别内源性配基（如激素、神经递质、生长和发育因子）或感觉信号 (如光、味
15、、视 和痛觉)。GPCRs 的作用是将信号跨膜传递给 G 蛋白（G-protein）3。GPCRs 在身体所有类型组 织几乎都表达4, 表明它们参与众多生理和病理转化过程。 GPCRs 分类有很多方法，通常使用的方法是将 GPCRs 区分成家族(A-E 家族)，然后再进一 步分出亚家族：A 家族（family A）受体类似于视紫红质（rhodopsin）和生物胺（biogenic amine） 受体；B 家族均类似于促胰液素（secretin）和降钙素（calcitonin）受体；C 家族类似于谷氨酸 （glutamate）受体；D 家族为真菌外激素受体（fungal pheromone re
16、ceptors） ；E 家族为环一磷酸 腺苷受体(cAMP receptors) 5。另一分类系统专门适用于哺乳动物 GPCRs，叫 GRAFS 分类系统 （GRAFS classification system） 。受体分成五大家族，以种系发生（生物种族的发展史）分析 （phylogenetic analyses）为依据分别命名为：Glutamate（G，15 个家族成员)，rhodopsin（R,701 个家族成员）, Adhesion（A,30 个家族成员） ，Frizzled/Taste2（F，24 个家族成员）和 Secretin（S， 15 个家族成员） 。其他 23 个蛋白序列不能归入任一家族被叫做“其他 7TM 受体”6，本论文运 用此分类系统。 Adehesion 家族也叫 B2 家族或叫 LNB-TM7 家族（long N-terminal seven transmembrane receptor
