《根皮素对人γбt细胞杀伤结肠癌sw-1116细胞影响及其机制探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《根皮素对人γбt细胞杀伤结肠癌sw-1116细胞影响及其机制探讨（47页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、l文I P PL D HM H CM T TN KP B M CP B SP F PP I中文全称细胞毒T 细胞二甲亚砜流式细胞术颗粒酶B异戊烯焦磷酸乳酸脱氢酶M a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x主要组织相容性复合体M e t h y lt h i a z o l y lt e t r a z o l i u mN a t u r a lk i l l e re e l lP e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l lP o r e - f o r m
2、 i n gp r o t e i nP r o p i d i u mi o d i n er h l F N - yR e c o m b i n a n th u m a ni n t e r f e r o n 丫，n lT C RH e l p e rTl y m p h o c y t eTc e l lr e c e p t o r四甲基偶氮唑蓝自然杀伤细胞外周血单核细胞磷酸盐缓冲液穿孔素碘化丙啶重组人干扰素丫辅助性T 细胞T 细胞受体徐州医学院硕士学位论文根皮素对人y S T 细胞杀伤结肠癌S W - 1 1 1 6 细胞的影响及其机制的探讨中文摘要目的探讨根皮素对人y S T
3、 细胞杀伤结肠癌S W - 111 6 细胞的影响及其机制。方法人外周血2 0 0 m l 离心分离，将外周血单个核细胞( P B M C ) 放入含2 u g m l异戊烯焦磷酸( I P P ) 的R P M l l 6 4 0 培养基中培养1 0 天，同时将不同浓度的根皮素作用于y S T 细胞及结肠癌S W - 1 1 1 6 细胞2 4 、4 8 及7 2 h 后，M 1 v r 法检i 贝! y 8 T 细胞及S W - 1 1 1 6细胞的生长；F C M 检测根皮素作用4 8 h 后的7 8 T 细胞P F P 、G r a B 及C D l 0 7 a 的表达；L D H 释
4、放法检测根皮素作用4 8 h 后，y S T 细胞对结肠癌S W - 1 1 1 6 细胞的杀伤活性；w e s t e mb l o t 法检测不同浓度根皮素作用4 8 h 后，y S T 细胞中W n t 3 a 的表达。结果I P P 作用1 0 天后，y S T 细胞的比例由3 1 2 增加到7 9 6 。M T T 结果显示，与对照组比较，浓度2 3 5 1 8 7 5 u g m l 的根皮素作用后，丫6 T 细胞的增殖率显著提高( P 0 0 5 ) ，w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp h l o r e t i ni n c r
5、 e a s e dm o r et h a n7 5 t g m l ，t h ei n h i b i t i o ne f f e c tt ot h ec o l o nc a n c e rS W l l16c e l l si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( P 。先将B 液混匀，再加入A 液A ：B 以1 ：5 0 的比例混合。( 3 ) 取试管若干，分组标号B S A ( p I ) 02 04 06 0样品量( 1 1 1 )1 01 01 01 0 D D H 2 0 ( m 1 ) 2 42 3 82 3 62 3 4
6、2 3 92 3 92 3 92 3 9使每管溶液总量均为2 4 m l 。( 4 ) 打开分光光度计预热。( 5 ) 取2 6 2 提取的蛋白，迅速按( 3 ) 表中剂量分别加样到标号的试管中，向上述每个试管中加入F o r l i n 甲2 m l ，振荡器迅速混匀后，3 0 水浴1 5m i n 。加入F o r l i n乙0 2 m l 显色，立即混匀3 0 。C 水浴3 0m i n 。酶标仪测O D 5 0 0 舢吸光度值( O D ) ，计算浓度C 。2 0 x O D 2 0 - 4 - 4 0 x O D 4 0 + 6 0 x O D 6 0B =2 0 2 + 4 0
7、2 + 6 0 2C - - - O D ( 样品) ，1 0 * B分装体积V = 4 0 01 t g C ( 样品) 。注：O D 2 0 、O D 4 0 、O D 6 0 分别为B S A 的2 0 p , 1 、4 0 9 l 、6 0 1 d 管的O D 值。然后根据C值计算得到等量蛋白所需样品体积v = 5 0J _ t g C ，按所需体积数转至新的E P 管，用双蒸水补齐体积至1 2 0 1 , t l ，加入4 蛋白处理液3 0 r t l ，沸水煮5 m i n 后将样品放置于2 0 待用。2 6 4S D S P A G E 凝胶电泳( 1 ) 一2 0 冰箱中取出加
8、样液及M a r k e r ，4 “ C 冰箱中缓慢化冻。( 2 ) 装配凝胶板将2 块胶板对齐，在水平桌面上固定于夹板中夹紧，使底面平齐，垫上胶垫，将夹板垂直固定于胶架上，备灌胶。( 3 ) 配胶按照下表中的配方，先配分离胶再配浓缩胶。1 4而s H C l ( 0 5 M ，p H6 9 )lA e r - B i s22 6 73 3 3 30 5 31O S D S0 0 8O 0 80 0 80 0 44 0 蔗糖1 2D D H 2 03 9 23 2 52 5 8 71 2 3T E M E D0 0 0 40 0 0 40 0 0 40 0 0 41O 黼0 0 40 0 4
9、0 0 40 0 2注：一般选择1 0 的分离胶。( 4 ) 上胶立即用吸管吸取分离胶，使胶沿玻璃板壁均匀缓慢流下，避免形成气泡，加双蒸水覆盖，看到水与胶之间出现一条折线时，表示胶已凝固，3 m i n 后倒掉上层封水，滤纸吸干。同样方法将浓缩胶加于分离胶上，至胶板顶端约1 2 m m处，迅速插梳，将梳子水平插入浓缩胶内，避免形成气泡。待浓缩胶凝固后，轻轻拔出梳子，取下夹板，将胶板从夹板中取出。( 5 ) 安装电泳槽将两块胶板放于电泳槽电极板两侧，小板向内，将装有胶板的电极板装入电极夹板中夹紧，放入电泳槽中，倒上电泳液，内槽倒满，外槽超过电极丝，用吸管吸去内槽内的气泡。( 6 ) 上样微量加样
10、器吸取样品2 0 1 x l ，枪头伸入加样孔中，缓慢加入样品，避免样品外溢，不同样品更换枪头，加入M a r k e r ( 分子量标记) ，盖上电泳槽盖子，插上电极。( 7 ) 电泳先恒压1 0 0 V ，至溴酚兰跑到浓缩胶与分离胶的分界处，再恒压2 0 0 V ，至溴酚兰跑到胶板底部( 或根据M a r k e r 分离的宽度选择) 。2 6 5 转膜( 1 ) 裁膜在玻璃板上，将N C 膜裁成8 c m x 2 c m 大小，将N C 膜一角切掉做好标徐州医学院硕士学位论文记( 上样端) ，分别放入加有电转液的培养皿中浸泡3 0 m i n 以上，N C 膜光面朝上，浮于水面3 0 m
11、 i n 。( 2 ) 裁胶与铺膜电泳结束后，关闭电源，取出胶板，在玻璃板上裁胶，先用裁胶板将胶板分开，撬下小板，切去浓缩胶，根据m a r k e r 选取切胶的范围，将胶切成8 c m x 2 c m 大小，先将1 层厚滤纸放在转膜槽的正极板上，用玻璃棒赶净气泡。然后放入N C 膜，光面向上，赶净气泡。放胶，胶和膜的标记端对齐，放上厚滤纸2 层，玻璃棒赶净气泡。( 3 ) 转膜盖上金属电极板( 负极) 及转膜槽盖子。先恒流，根据膜的大小计算电流：电流= 膜的面积2 5 转膜数= 2 x 8 x 2 5 x l = 4 0m A ，电压：2 4 V 。时间：根据分子量计算：小于6 0K D
12、的= 分子量+ 1 0 ( 分钟)根据实验要求，设定好恒流、电流、电压、电泳时间，然后运行。( 4 ) 整理清理剩余胶，将胶板放入小盆中浸泡。回收电泳液，将玻璃板、电泳槽、电极板、电极夹板放入水盆中浸泡，备清洗。( 5 ) 封闭转膜结束后，关闭电源，取出N C 膜，将N C 膜胶面向上放于装有W a s h i n gb u f f e r 培养皿中，摇床上洗3m i n ，洗去N C 膜上的转移液，倒掉W a s h i n gb u f f e r ，加入封闭液，封闭1 h 。( 6 ) 清洗整理D D H 2 0 擦洗转膜槽的正负电极板3 遍，晾干后盖上。将浸泡的实验器材先用自来水清洗干
13、净，D D H 2 0 清洗，仪器柜中晾干，擦净实验桌面及地面。( 7 ) 一抗孵育平缓摇动l h 后回收封闭液，加入新鲜配制的1 ：5 0 0 稀释的鼠抗人W n t 3 a 单克隆抗体及I a e t i n 多克隆抗体，4 “ C 过夜。( 8 ) 二抗孵育W a s h i n gb u f f e r 洗膜3 m i n x 3 次，加入相应二抗1 ：1 0 0 0 稀释( 碱性磷酶标记的兔抗鼠I g G ) ，3 7 。C 平缓摇动1 h 。( 9 ) 显色回收二抗，加入W a s h i n gb u f f e r 洗膜3 m i n x 3 次，滤膜浸入N B T B C I
14、 P显色液，显色适当时间后清水冲洗终止反应。( 1 0 ) 取出条代晾干，拍照。1 6徐州医学院硕士学位论文2 7 统计学处理采用S P S S l 3 0 软件进行统计学处理，计量资料使用均数4 - 标准差( 孑J ) 表示，采用单因素方差分析( O n e - w a y A N O V A ) ，两两比较使用S - N K 法或者D u n c a n 法，C D l 0 7 a 与P F P 、G r a B 及杀伤活性采用S p e a r m a n 相关分析，检验水准a = 0 0 5 ，P 0 0 5 ) ，提示高浓度的根皮素对S W - 1 1 1 6 细胞的生长具有抑制作用
15、( 详见表2 ) 。1 9徐州医学院硕士学位论文表2 不同浓度根皮素作用2 4 、4 8 、7 2 h 后对S W - 1 1 1 6 细胞生长的影响( n = 1 0 ，i s )注：幸与对照组相比P O 0 5 ) ，结果如表3 ，图8 ，9 。表3 不同浓度根皮素作用4 8 h 后7 S T 细胞G r a B 、P F P 及C D l 0 7 a 的表达( ) ( n = 5 ，i s )注：与对照组比较P 0 0 5 ；# 与2 3 5J _ t g m l 组及4 7g g m l 组比较P 0 0 5 ； 与2 3 5 I - t g m l组比较P 0 0 54 杀伤活性检测
16、结果经不同浓度根皮素作用后，T 6 T 细胞对结肠癌S W - 1 1 1 6 细胞的杀伤活性随着药物浓度的增加逐渐增强，浓度在3 7 5 9 9 m l 时杀伤活性达最高峰( 8 9 ) ，各实验组与对照组( 3 8 3 ) 比较，差异显著( 尸 o 0 5 ) ，且各实验组间比较差异有统计学意义( 尸 0 0 5 ) ，结果见图1 0 ，表4 。以上结果提示，在浓度2 3 5 3 7 5 u g m l范围内，根皮素能够呈剂量依赖性提高y S T 细胞对S W 11 1 6 细胞的杀伤活性。2 11 8 7 53 7 57 58 0 8 士2 7 8 9 3 4 - 1 9 8 3 5 + 1 5 注：表不与对照组比较尸 o 0 55 相关分析结果5 1C D l 0 7 a 与P F PS
