猪瘟分离毒e2基因序列分析和强弱毒检测方法探讨

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1、扬州大学硕士学位论文猪瘟分离毒E2基因序列分析和强弱毒检测方法的探讨姓名：胡仁莉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：高崧;刘秀梵20060501胡仁莉：猪瘟分离毒E 2 基因序列分析和强弱毒榆测方洼的探讨猪瘟分离毒E 2 基因序列分析和强弱毒检测方法的探讨研究生：胡仁莉导师：高崧教授刘秀梵教授中文摘要本文以猪瘟流行毒自然感染发病猪的脾脏为材料，提取组纵总R N A ，根据己报道的C S F VE 2 基因序列设计合成特异性引物，以组织总R N A 为模板，利用反转录聚合酶链式反应( R T P c R ) 测定技术，对流行于江苏地区流行毒株的主要外膜糖蛋白E 2 基因的核苷酸序列进行了

2、测定，用D N A S t a r 软件比较分析了5 株流j 亍毒之间以及它们与猪瘟兔化弱毒株( C 一株) E 2 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性，分析了猪瘟流行毒的变异程度及其与C 一株的分子差异，并通过系统进化树分析，确定其遗传关系，从分子生物学角度研究造成目前猪瘟仍频繁发生的可能原因。在此基础上，我们对已发表的强毒株石门株( S M 株) 、B r e s c i a 株、A l t o r t 18 7株、E s y s t r u p 株和弱毒株G P E 株、c s 株、R i c t u s 株和C 一株的序列进行酶切位点分析，找到强毒株在2 8 2 b p 处有一

3、个A v aI ( B m e T I l OI ) 酶切位点而弱毒株却没有。接着我们用限制性片段长度多态性分析法( R F L P ) 对P C R 产物进行分析。从本研究结果看，用引物P 1 P 2 和R F L P 分析技术可作为将兔化弱毒和流行野毒区分丌来的一种方法，而且应用该方法更方便、易行，这将对预防猪瘟有一定的实际意义。限于受检毒株的来源及数量，该方法的应用普遍性还有待于进一步的实验论证。关键字：猪瘟病毒；E 2 基因；反转录- 聚合酶链式反应( R I - P C R ) ；序列分忻限制性片段长度多态性分析法( R F L P )j扬州大学硕t 学位论文S t u d yo n

4、t h eE 2G e n eN u c l e o t i d eS e q u e n c e so fC l a s s i c a lS w i n eF e v e rV i r u sF i e l dS t r a i n sa n dt h e i rp o t e n t i a lm o l e c u l a rd i f f e r e n c ew i t ht h eA t t e n u a t e dC l a s s i c a lS w i n eF e v e rV i r u sL a p i n i z e dM S C a n d i d a t e

5、 ：H UR e n l iA d v i s o r ：P r o f G a oS o n gP r o f L i uX i u f a nA b s t r a c tE 2g e n e se n c o d i n gt h em a jo rp r o t e c t i v ea n t i g e nr e g i o no ff i e l dc l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u s ( C S F V ) i s o l a t e sf r o mJ a n g s ua r e aw e r ea m p l i f i

6、 e da n da n a l y z e db yr e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) a n dr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( R F L P ) r e s p e c t i v e l y E 2g e n e so fc l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u sf i

7、l e di s o l a t e sf r o mJ i a n g s ua r e aw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d C o m p a r i s o na n da n a l y s i so ft h en u c l e o t i d es e q u e n c e sa n dt h ed e d u c e da m i n os e q u e n c e sa m o n gt h e s es t r a i n sw i t hC S F VC - s t r a i nw e r ep e r f o r m

8、 e db yc o m p u t e rw i t ht h eD N A s t a rs o f t w a r e T h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft h ef i v es t r a i n sw a sa n a l y z e db yt h ep h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e do nt h eb a s eo ft h ed a t ao ft h eE 2g e n ew i t hc o m p u t e rs o f t w a r e T h

9、 er e s u l t ss h o w e ds o m es u b s t i t u t i o n so fn u c l e o t i d e so rd e d u c e da m i n oa c i d ss c a t t e r i n ga l o n gt h eE 2g e n e so rt h e i re n c o d i n gp r o t e i n sc o m p a r e dt Ot h o s er e p o r t e dB a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，c l a s s i c

10、a ls w i n ef e v e rv i r u sv i r u l e n ts t r a i n s ，s u c ha sS M - s t r a i n ，B r e s c i as t r a i n ，A l f o r t 一18 7s t r a i na n dE s y s t r u ps t r a i na l lw e r ef o u n dt Oh a v eo n er e c o g n i t i o ns e q u e n c eo fA v aI ( B m eT 110I ) w i t h i nE 2g e n e ，w h i

11、 l ea t t e n u a t e ds t r a i n s ，s u c ha sG P Es t r a i n ，C Ss t r a i n ，R i e m ss t r a i na n dC s t r a i nw e r en o tf o u n d T h e nr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( R F L P ) w a sa p p l i e dt oa n a l y s i st h eR T - P C R胡仁莉：猪瘟分离毒E 2 基因序

12、列分析和强弱毒检测方法的探讨p r o d u c t T h es t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tv i r u l e n ts t r a i n so fC S F Vc o u l db ed i s t i n g u i s h e df r o mt h o s ea R e n u a t e do n e sb a s e do nt h er e s u l t so fR T - P C Rw i t hp r i m e rP1 P 2a n dR F L Pt e c h n i q u ei nt h i ss t u

13、d y , a n dt h i sd i s t i n g u i s h i n gm e t h o dw a sm o r ec o n v e n i e n ta n df e a s i b l et h a ns o m eo t h e rb i o l o g i c a lm e t h o d s ，w h i c hw o u l dp l a yas o m e w h a tr o l ei nd i a g n o s ea n de p i d e m i cs t u d yo nc l a s s i c a ls w i n ef e v e rK e

14、 yw o r d ：C l a s s i c a ls w i n ef e v e rv i r u s ；E 2g e n e s ；R e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) ；S e q u e n c ea n a l y s i s ；R e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( R F L P )胡仁莉：猪瘟分离毒E 2 祭l

15、大| 序列分析和强弱毒榆测方法的探讨a aa m i n oa c i d基酸A m pA m p i c i l l i n 氨苄青霉素b pb a s e p a i r 碱基对符号说明C S Fc l a s s i c a ls w i n ef e v e r 古典猪瘟F C Sf e t a lc a l fs e r u m 胎牛血清1F I T Cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n n a t e 异硫氰酸荧光素gg r a m 克hh o u r 小时H Ch o gc h o l e r a 猪瘟H P R I h u m

16、a np l a c e n t ar i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r 核糖核酸酶抑制剂I I Fi n d i r e c ti m m u n o f l u o r e c e n ta s s a y 问接免疫荧光试验I g Gi m m u n g l o b u l i nG 免疫球蛋白GI P T Gi s o p r o p y l - B D t h i o g a l a c t o s i d e丙基硫代半乳糖吡哺苷M i nm i n u t e 分m Lm i l l i l i t e r 毫升m o lm o l e 摩尔m o l Lm o l e l i t e r 摩尔升P B Sp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液生理盐水P B S Tp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n ea d dt w e e n 一2 0 洗涤缓冲液P C Rp