《牛疱疹病毒1型编码ul0.5基因对牛疱疹病毒5型神经致病性影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《牛疱疹病毒1型编码ul0.5基因对牛疱疹病毒5型神经致病性影响（54页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、，_，i华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文7如需保密，解密时间年月日是否保密，各独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意研究生签名：知喝彳j时间：d ，年岁月岁日学位论文使用授权书黼鲐纽畸吒铷戥匆知签名日期：o lo t 年 月专? 日签名日期：加f 年蚋；7 日牛疱疹病毒l 型编
2、码的U L O 5 基因对牛疱疹病毒5 型神经致病性的影响目录摘要1A b s t r a c t 3缩略语表( A b b r e v i a t i o n ) 5第1 章文献综述6弓I 言61 1B H v - 5 的发现及分类地位61 2B H V 5 的分子生物学特征71 3 致病机理91 4 研究目的与意义1 l第2 章材料与方法1 22 1试验材料：122 2 试验方法162 2 1转移载体的构建1 62 2 2重组病毒的构建1 82 2 3一步法增殖曲线2 12 2 4空斑试验212 2 5反转录和R e a l - t i m eP C R 试验2 12 2 6病毒粒子的电镜
3、观察2 22 2 7抗B H V - 5 牛血清的制备2 32 2 8动物试验2 32 2 9磁共振成像( M a g n e t i cR e s o n a n c eI m a g i n g ) 2 42 2 10 免疫组化试验2 5第3 章结果与分析。2 73 1U L 0 5 基因的生物信息学分析2 73 2U L 0 5 基因的生物学特性2 73 3 重组病毒的构建与鉴定2 83 3 1B H V - 5E G F P 嵌合突变株的构建2 83 3 2牛疱疹病毒5 型U L 0 5 嵌合突变株的构建3l3 3 3牛疱疹病毒5 型U L 0 5 嵌合病毒回复突变株的构建3 43 4
4、 重组病毒生物学特征分析3 53 4 1空斑大小比较3 53 3 2病毒的一步法生长曲线3 63 3 3病毒粒子电镜观察3 6参考文献4 6致谢51牛疱疹病毒1 型编码的U L 0 5 基因对牛疱疹病毒5 型神经致病性的影响摘要牛疱疹病毒1 型和5 型同属于a 疱疹病毒属，二者的氨基酸相似性高达8 2 以上，而且其宿主动物主要是牛。但引起的临床症状却截然不同：由牛疱疹病毒 1 型( B 阱1 ) 引起的传染病俗称牛传染性鼻气管炎，是一种牛的急性、热性、接触性传染病，主要引起呼吸道和生殖道疾病等，侵染途径主要是通过鼻腔到达三叉神经节最后形成潜伏感染；而B H V - 5 是一种嗜神经性病毒，经鼻
5、腔到达嗅球或直接到三叉神经节形成潜伏感染，病毒会通过顺式转运侵染中枢神经系统，从而引起癫痫等神经症状。由于这两种传染病最终都可以在三叉神经节形成潜伏性感染而导致终身带毒，还有该病毒还有很多基因的功能以及二者在致病机理和临床表现的联系与区别还没有研究清楚，因此给该病的防治带来诸多困难。通过基因组比较，发现U L 0 5 基因只在B H V - 1 中编码。因此，本文对B H V - 1 中U L 0 5基因在B H V - 5 中的功能进行研究，初步探究二者在临床症状不同的原因、病毒与宿主互作的分子机制以及在神经系统的感染机理。我们首先从B H V - 1 基因组中克隆U L 0 5 基因，然后
6、利用同源重组的方法整合到B H V - 5 的基因组中形成嵌合病毒，然后分别通过体外实验和体内试验来对比亲本病毒和重组病毒的差异。1 、体外实验本文首先通过反转录试验证明了U L 0 5 基因可以转录为R N A ，然后用磷酸钙共转染的方法构建了B H V - 5U L 0 5 嵌合病毒以及其回复突变株，并且分别用P C R测序和S o u t h e r nb l o t t i n g 对重组病毒进行验证。在U L 0 5 基因成功嵌合到B H V - 5 的基因组后，我们分别设计空斑大小比较、一步法增殖曲线和电镜试验来验证其在增殖能力上的区别。通过试验我们发现在相同的条件下相对于B H
7、V - 5 野毒和回复突变株，嵌合病毒在细胞上形成的空斑明显减小，但其病毒粒子的大小却没有明显区别。然后取不同的时间点来验证病毒的增殖趋势，发现嵌合病毒在早期的增殖能力也明显的低于亲本病毒。R e a l t i m eP C R 试验表明U L 0 5 基因的插入影响了B I C P 0 基因的正常表达，但其下游同源臂O R F 2 基因的表达没有受其影响。通过在体外进行的一系列试验，我们对U L 0 5基因的功能有了初步的认识。U L 0 5 基因可以作用于B H V - 5 基因组中其他基因，从而抑制了病毒在细胞上的增殖能力，并且降低了病毒的滴度。2 、体内实验将试验兔随机分成4 组：空
8、白对照组、B H V - 5w t 组、B H V - 5U L 0 5 组和B H V - 5U L 0 5 R 组。用鼻腔攻毒的方法对新西兰白兔进行攻毒试验，将不同攻毒组分开饲养，连续注射3 天地塞米松并连续观察1 4 天，到攻毒后第5 天，野毒组和回复突2牛疱疹病毒1 型编码的U L O 5 基因对牛疱疹病毒5 型神经致病性的影响A b s t r a c tB o v i n eh e r p e s v i r u s1 ( B H V - 1 ) a n d5 ( B H V - 5 ) a r et w oc l o s e l yr e l a t e da l p h a h
9、 e r -p e s v i r u sf o rw h i c ht h ep r i m a r yh o s ta r em a i n l yc a t t l e T h eB H V - 1a n dB H V - 5e x h i b i ta na v e r a g eo f8 2 a m i n oa c i di d e n t i t ya m o n g s td i f f e r e n tp r o t e i n s ，b u tt h ec l i n i c a ld i s e a s e sa r ec o m p l e t e l yd i f
10、f e r e n t ：B o v i n ei n f e c t i o u sr h i n o t r a c h e i t i sc a u s e db yB H V - 1i sk n o w na sa i la c u t e ，p y r e x i ca n dc o n t a g i o u sd i s e a s et h a tc a u s e da b o r t i o n , r e s p i r a t o r y ,a n dg e n i t a li n f e c t i o n s T h ep a t ho fi n v a d i
11、n gi st h a tv i r u se s t a b l i s h i n gl a t e n c yi nt h et r i g e m i n a lg a n g l i o nt h r o u g ht h en a s a lc a v i t y B u tB H V - 5i sah i g h l yn e u r o v i r u l e n tv i m V i r u sc o u l d r e a c ho l f a c t o r yb u l bo rt r i g e m i n a lg a n g l i ad i r e c t l
12、yf r o mn a s a lc a v i t y ，i ti st r a n s p o r t e dt ot h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e mb ya n t e r o g r a d et r a n s p o r t A tl a s ti tl e a d st h en e u r o l o g i c a ls y m p t o m ss u c ha se p i l e p s y B e c a u s eb o t hB H V - 1a n dB H V - 5C a ne s t a b l i s h
13、l a t e n c yi nt h et r i g e m i n a l ( T G ) ，t h ea n i m a l sc a r r i e dt h ev i r u sl i f e l o n g S oi tb r i n g sm a n yd i f f i c u l t i e st ot h ep r e v e n t i o na n dc u r e F u r t h e r m o r e ，t h ef u n c t i o no fm a n yg e n e s ，p a t h o g e n i cm e c h a n i s ma n dc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n sb e t w e e nt w ov i r u sa r es t i l ln o tv e r yc l e a r O nt h eb a s i so fg e n o m i cc o m p a r i s o n s ，B H V - 5e n c o d e st h ef u l lc o m p l e m e n to
