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1、分子标记及其在药用植物分析研究中的应 用要 ：分子标记作为一种先进的遗传标记已被广泛应用于药用植物的育种、资源评定、多样性保护、亲缘关系鉴定、品种鉴定等方面的研究中，对于药用植物的利用、开发及保护起到了重要的作用。关键词：分子标记；药用植物1. 引言目前，国内外各类新药的研制日益趋向传统中药及其天然产物，但药用植物的研究和应用中存在以下问题：植物资源严重缺乏或枯竭，生物多样性受到严重破坏，开发困难；中草药市场上存在的品种混乱和部分品种品质低劣的问题，地道药材的鉴定较为困难；相当一部分重要活性物质的代谢(一般为次生代谢)过程的基础研究相对薄弱， 其产生、 调节的基本过程以及在此过程中的关键酶和关
2、键基因不明；有效成分及其作用机理不详。而分子遗传标记作为一种先进的遗传标记技术，表现出其相对于传统遗传标记的巨大优势。在药用植物的研究中的应用为解决上述问题提供了一种崭新的手段。目前，常用的药用植物遗传标记的主要有4 种： （1）形态标记（ morphological markers ） ：这是传统的中药学最重要的鉴定方法； （2）生化标记（biochemical markers ） ：这是建立在现代仪器分析的基础上主要依据部分化学成分，尤其是有效成分的化学分析对药用植物进行标记和分类的方法；（3）细胞标记（cytological markers） ：主要指染色体的核型和带型特征；（4）分子标
3、记（ molecular markers ） ：是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记，即指可遗传并可检测的生物大分子标记。狭义概念仅指DNA 分子，而广义的分子标记则包括同工酶和储藏蛋白等生物大分子标记在内。在上述 4 种遗传标记中，同工酶分子标记和DNA 分子标记具有快速、准确、适应性广等特点，现已被越来越多地应用于药用植物和其他作物的遗传分析、发育分析、遗传育种、多样性分析和保护、品种和品质鉴定、亲缘关系鉴定、新药或新药材的开发利用等诸多方面。2. 同工酶标记及应用同工酶是指一类底物相似或完全相同的酶分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一簇酶。它们可能由等位基因决定，也可能受到非等
4、位基因的控制。前者被称为“等位酶 “。所以，同工酶标记事实上包括等位酶在内。由于不同的同工酶形式在分子量和电荷等方面的差异，可以利用凝胶电泳技术将它们分开，用专一的底物和特殊的染料染色，在胶柱中呈现同工酶谱，并可以借助光学扫描技术和相应的计算机分析软件 进行定量分析。同工酶作为生物基因表达的产物，受到严格的遗传控制。所以同工酶可以作为物种的遗传标记，对于物种和亲缘关系的鉴定、新药材的寻找和开发、药用植物的发育生物学分析等方面具有一定的意义，在分子标记的发展中起到了重要作用。何和明等人曾测定分析了海南岛槟榔、益智、忍冬、绞股蓝、杜仲、灵芝、紫苏子、菟丝子等8 种药用植物的过氧化物酶（POD）同工
5、酶的活性比、酶谱带数、迁移率等，结果表明药用植物种类、部位、POD 活性、酶谱与分布差异明显。霍丽云等人利用柴胡和石防风两种药用植物经过原生质体融合及组织培养后，取融合细胞来源的愈伤组织进行脂酶同工酶图谱分析，测得杂交细胞基因重组后新的脂酶表达物的出现，从而预测杂交细胞的优势组合。因为同工酶是基因表达的产物，受到生物在发育过程中基因表达的时序控制，所以同一生物的不同发育期会表现出不同的同工酶酶谱，这给物种间关系的研究造成了一定的干扰。因此同工酶分析在药用植物的研究上受到发育阶段和环境条件的影响，在研究中特别强调取材的一致性。另外 ,尽管等位酶的表现型与基因型有较好的关联，但它只能反映一部分功能
6、基因（外显子）的情况，而对大部分功能基因和大量非功能基因无法表现，使在其应用范围上有一定的局限性。因此在遗传多样性,QTL( 数量性状基因定位)制图、分子标记辅助育种、分子进化等需要大量标记的研究中，同工酶标记逐渐为DNA标记所取代。尽管如此，同工酶分子标记以其共显性表达、重复性强、操作简便等优点使其仍在种群遗传、分子进化、适应的分子基础、功能基础的克隆等方面具有DNA标记所不可替代的作用。3. DNA 分子标记DNA 分子标记是指由于DNA 分子发生缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性标记。从1974 年 Grodzicker 等创立限制性片段长
7、度多态性（RFLP）技术以来，尤其是在近十年中，DNA 分子标记的研究十分活跃，相继有数十种不同的分子标记技术问世。DNA 分子作为遗传信息的载体 ，不受外界因素、生物个体发育阶段及器官组织差异的影响，而不同的物种所含有的DNA 分子不同。因而最能揭示物种的本质。同时， DNA 分子的化学稳定性比RNA 、蛋白质、 同工酶等高。 即使在生物体死亡之后，细胞中的DNA也不会像同工酶、蛋白质那样很快失去活性或分解，这样，就突破了蛋白质（包括同工酶）分析需要新鲜材料进行测试的限制。而且随着DNA分析和操作技术的不断完善，目前已经可以对微量甚至单细胞中的痕量 DNA 分子进行分析和操作，分析的精确度也
8、不断提高，甚至可以检测出不同DNA 分子中单个核苷酸的差异的。这为药用植物的DNA 分子标记技术提供了可靠的技术保证，促进了近年来DNA 分子标记的快速发展。目前该技术大致可分为三类：第一类以电泳技术和分子杂交技术为核心，其代表性技术有RFLP 和 DNA 指纹技术（ DNA Finger printing） 。前者主要是以低拷贝序列为探针进行分子杂交，后者主要是以重复序列包括串联重复序列（如卫星DNA 、小卫星DNA 和微卫星DNA ）和散布重复序列（如转座子、逆转座子）为探针进行分子杂交。 第二类以电泳技术和PCR 技术为核心， 其代表性技术有RAPD（Random amplified p
9、olymorphism DNA） 、SSR （Simple sequence repeat，或称 Simple sequence length polymorphism, SSLP ，或称Sequence-tagged microsatellite site，STMS）和AFLP （Amplified restriction fragment polymorphism） 。第三类以DNA 序列分析为核心的分子标记技术， 其代表性技术为ITS（internal transcribed spacers ）18测序分析技术。现将三类代表性分子标记技术列表（表 1） 。表 1. 几种代表性分子标记技术
10、分子标记技术适合 基因组多态性水平核心技术技术难度可靠性类RFLP DNA 指纹技术类RAPDSSR 标记AFLP类rDNA 区域测序动植物种、属动物、植物动物、植物动物、植物微生物、植物、动物动物、植物动物、植物中较高较高高高中 电泳技术 ,分子杂交技术电泳技术 ,分子杂交技术电泳技术 ,PCR 技术电泳技术 ,PCR 技术电泳技术 ,PCR 技术DNA 测序技术较高较高低较低较高中 较高较高较低较高较高较高当然，这种区分不是绝对的，有些分子标记技术是介于第一、二类之间， 如：微卫星 DNA（microsatellite DNA ）既可以作为探针进行分子杂交以测定DNA 多态性 （如DNA
11、指纹技术），也可以作为引物进行PCR 扩增以测定DNA 多态性（如SSR 技术） 。有些分子标记技术是介于第二、三类之间。如：SCARS （Sequence characterized amplified regions）是对特异RAPD 条带进行克隆并测序，并以此测出序列的末端14nt 加上原来RAPD 所用的10nt 的随机引物合成出24nt 的寡聚核苷酸为引物，然后用此引物进行PCR 扩增，以测定基因组DNA 的多态性。这些分子标记技术各有其优缺点，因此，采用哪类分子标记应依据实验目的、实验材料、实验条件等来决定。而且，上述众多分子标记技术中没有哪种技术是十分完美的，特别是在品种鉴定等研
12、究方面，仍须进一步探索出可靠性高、重复性好而又简便易行的分子标记技术。4. DNA 分子标记技术在药用植物上的应用DNA 分子标记技术用于药用植物研究是近年来兴起的。但其进展和取得的成就却令人鼓舞，为中药材的研究注入了新的活力。在中药鉴定、药用植物生物多样性保护、中药材道地性分析等方面的广泛应用对实现我国中药材现代化和国际化有着及其重要的作用。4.1 在药用植物资源与生物多样性保护上的应用药用植物资源的研究目前多采用经典的形态分类学方法。其划分物种方法是建立在个体性状描述和宏观观测水平上，得到的结论往往不完善，易引起争论。往往出现同名异药或异名同药的现象。DNA分子遗传标记技术直接分析遗传物质
13、DNA 在不同生物个体间的差异，使植物分类和资源的研究更加科学化。陈永久等用RAPD 技术分析了冬虫夏草Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.的遗传分化，通过遗传距离说明遗传差异度与地理距离呈正相关。黄璐琦等采用RAPD 技术，对中药白芷的种质资源进行了分析。丁士友等对黄芪亚族Astragalineae 的分子系统学研究，其研究结果不仅为黄芪亚族的分类学研究提供了线索，而且为中药黄芪 利用新的药用资源提供了线索。汪小全等用RAPD技术对升麻属（Cimicifuga L.）的5 个种和类叶升麻（Actaea asiatica Hara）及乌头属（Aconitum ）的一种进
14、行了遗传多样性的研究。所以DNA 分子标记技术从本质上揭示物种遗传变异及其变异规律，有助于预测物种的命运，从而制定出相应的管理措施，实现药用植物资源研究与保护的科学化与现代化。4.2 在药用植物遗传育种上的应用我国多个大面积药材种植基地的建立标志着我国的中药材生产从主要依靠野生资源转向规模化和标准化种植。要达到优质、高产、标准化生产药用植物的目的，所用品种的改良对药材生产起着决定性的作用。“高含量育种 “是药用植物育种的主要目标。遗传图谱是生物种类的分子档案，对育种工作者有极大的参考价值。利用RFLP、RAPD 等分子遗传标记技术，构建重要药用植物遗传连锁图，开展重要药用植物OTL 的研究和实
15、践，从野生性筛选优良品种，实现药用植物杂交强优结合,将成为今后药用植物育种的重要方向之一。目前应用RAPD技术已构建了一些重要农作物的遗传图谱。但在药用植物方面还需加大研究的力度，为药材的开发利用打下坚实的基础。4.3 药用植物道地性研究上的应用道地药材具有强烈的地域性，表现在它们往往分布在某些狭小的区域，或虽分布较广但只有某些狭小生境区的质量最好、疗效最佳、产量最大。道地性药材的质量、疗效、产量等受到所在地的限制的原因是植物的遗传物质 DNA 及初生的和次生代谢过程中的酶系统发生了道地性的变化。因道地性药材与非道地性药材是同种，二者在形态和生药性状等特征上差别不明显，给鉴别带来困难，采用DN
16、A 分子遗传技术并辅以等位酶技术，可以从分子水平区分道地性药材。陈林姣等（1998）采用RAPD技术对中药溪黄草类4 种原植物进行了鉴定研究，对药材的 “道地性 “ 研究有重要意义。4.4 在药用植物亲缘关系鉴定上的应用目前药用植物亲缘学所采用的往往是药用植物的小分子成分，即植物的次生代谢产物，而忽视了大分子成分如 DNA ，但它们从本质上反映了药用植物的亲缘关系，而且决定着药用植物药效成分形成过程中的关键酶的合成等。所以，现在很多学者建议应把小分子化合物和DNA 结合起来考虑，才能更有效地研究药用植物的亲缘关系。日本学者神田博史研究发现竹节参Panax japonicus 的主要皂苷在狭叶假人参 P. japonicus var.angustifolius 中有相当高的含量但RAPD 和 RFLP 分析表明这两种植物有明显区别。可见，植物大分子成分与小分子成分之间的关系尚待深入研究。在国内对这方面的研究已有诸多报道。汪小全等用5 个引物对升麻属（Cimicifuga L. ）的 5 个种和类叶升麻（Actaea asiatica Hara）及乌头属（ Aconi
