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1、! 卷 “ 期 !#$ 年 % 月生物工程学报 !“#$%460 ?6 ?4 ,996:/3 A- B645: C6D E“F G:/D 8B610,(:,64( H/946:D/5: C I95315B 4,:%?2 (- =1*#0),/)*+, 40#%$0%)%02*(0(00)， 培养方法参见文献? 中 克 隆 有 嗜 热 火 球 菌!“#$%$%-6A 上克隆 有衣藻叶绿体 *245 基因 =B端启动子、 #6%7 基因 %B端终止子和一组多克隆位点，; 为 GH4J2O8 公司产品， NE 引物由上海生工生物工程有限公司合成， (:? 序列测定由上海基康生物技术有限公司完成， 引
2、物标记试剂盒购自美国 N)H92L- 公司， 同位素 （!%#!N!M?JN） 购自北京亚辉生物工程公司。!“#方法!“#“!质粒提取、 (:? 片段克隆、 重组质粒鉴定： 参 照 P-9D)HH1 等=分子克隆方法。!“#“#基因枪转化： 采用美国 QRS!E?( 公司 KHM2GN(P!“$T,2 Q.HG./6.O -)6.OG2 M2G.52)7 /7/629 转化衣 藻。参数为： 真空度 #U.4O82/ 汞柱、 轰击距离 VO9、氦气压力 “$/.、 金粉颗粒直径 “C$9。!“#“$衣藻 (:? 的提取， 参阅文献;。!“#“%衣藻蛋白质提取， 参阅文献$， FHGC#， :HC
3、,?*)#ABC# /4567(/8,55 CE*A*!“#A“)D*AF“# 2;： E*F*=*B DA“=F()#!“!衣藻叶绿体的转化及转基因衣藻的获得 用包裹有质粒 !9.% 的金粉子弹轰击野生型衣藻受体细胞， 过渡培养后涂布于抗性筛选 H%I 培养基上 （含壮观霉素 J!C ,KK$=LFM） ， N3O， 5KKKP 的连续光照条件下培养。Q R ,KG 后平板上出现绿色的单藻落， 而空载金粉轰击的野生型衣藻细胞在抗性筛选 H%I 培养基 （含壮观霉素 J!C ,KK$=LFM） 上则完全白化死亡。这些绿色抗性单藻落能在二次继代筛选的抗性选择培养基中正常生长， 这初步表明高温#1
4、淀粉酶基因和 (8. 基因可能通过同源重组整合 到衣藻叶绿体基因组中。本实验共轰击 S 枪， 得到T 个抗性衣藻单藻落。!“#转基因衣藻的 $%NI?6 “)“U /4567(/8,55 #A“)D*AF“)# *D ()2 =()(,：,-K/0 78% F“A/(A（IA*F(=“） ；N：#E( + /4567(/8,55 #A“)D*AF“)# !“转基因衣藻同质化程度的 $%195 D8152 “#$ 9: ;142?49:BDB;8,7424?98=2=6=6=B;?9C ;7C=；G45= !：C.-$ 48 ;DB;8C?9,= F1; ;7C=； ! I K：!3 “#$%?
5、458:9?45;615=83!“.转基因衣藻!/淀粉酶活性的测定 采用 A99271J#=6895L方法， 用经过 . 轮抗性筛选的衣藻转化子的总蛋白提取液测定!J淀粉酶活性， 结果 （图 K） 表明， 测定的 ! 株衣藻转化子均表现出较高的!J淀粉酶活性， 其中最高的酶活力为MM)KDN2 鲜重衣藻。图 K衣藻转基因植株!J淀粉酶活性分析0123K$5467818 9: ?=B9,1545;!J47648= 4B;1H1;1=89: !3 “#$%?458:9?45; 615=8!“0转基因衣藻的表型分析 野生型衣藻与其它一些植物不同， 能在黑暗中合成光非依赖性叶绿素 （612=C=5=5
6、; B=C=5=5;C?9;9B= ?=DB;48=） ， 它由 /淀粉酶基因导入叶绿体转化模式植物 衣藻叶绿体中并获得表达， 为在叶绿体中表达工程酶进行了一些有意义的探索。虽然在筛选到的衣藻转化子中， 淀粉酶的活性可达 8?$ 鲜重衣藻， 但表达量与微生物表达系统相比还是比较低的。因此， 对于这种性质特殊的极端酶， 如何进一步提高其在叶绿体表达系统中的表达量， 还有待于进一步的研究。叶绿体起源于原核生物蓝细菌， 遗传表达具有原核性A， 其基因组基因的排列方式、 调控方式、 BC 碱基对含量及翻译所偏爱的密码子与原核生物相接近， 可以直接表达来自原核生物的基因， 无需进行繁琐的密码子优化改造。
7、但高温!;淀粉酶基因来源于极端高温菌 !“#$%$%淀粉酶 基因的表达， 保证了外源基因的表达， 但为了进一步提高外源基因的表达量， 很有必要继续克隆和改造能在叶绿体中执行功能的强启动子和合适的终止子。叶绿体遗传转化不同于核转化， 是通过一对与叶绿体基因组同源的 JK3 序列将外源基因定点整合到叶绿体基因组中， 不存在核转化的位置效应， 但整合位点在叶绿体基因组中的选择也影响外源基因的表达， 即不同插入位点对转化频率和表达效率也有影响， 当然这是以整合位点的选择和外源基因的插入不破坏叶绿体本身基因结构为前提的。因此通过对叶绿体转化载体的优化和改造， 可以进一步提高外源基因在叶绿体中的表达量。“
8、#$#“#%02,601(./*2+(,-(/+(/2*-#6#:0/:0(*) !“#$%$%)%#$.)$3$8“ *7)2?，Z0/% HAA，-% V WF F J0)#(66 Y，0) ZL，366#1*) % Z#6(1+*)(1 #) :6*/*-601+ $()(+#:()$#)(/#)$： 0) ()#/*)2()+066, ./#()46, (/0 #) Q#*+(:)*6*$,% 5#27 L02Q/*9 M， “/#+1: O“， Z0)#0+#1 D%Z*6(:860/ C6*)#)$： 360Q*/0+*/, Z0)806 Z % C*64 L-/#)$ Y0/Q*
9、/ 0Q*/0+*/, C6(/2*)+ M，O/#:91*) M%Z*6(:860/ Q#*6*$, *. 913*:“F V H V FGA AZ:Q/#4( O，L:00. JM，J06(, Z 2+ *3% C*)+/*66(4 (T-/(11#*) *.-601+#4 +/0)1$()(1 #) -60)+1 Q01(4 *) 0 )8:6(0/ ():*4(4 0)4 -601+#4 +0/$(+(4 D L:*/(/ C3， 78:9*6S B， C60/( MM 2+ *3%D( #)+/0:(66860/-/*48:+#*) 0)4 1(:/(+#*) *. Y_P; ()(6*-( -/*+(#) #) 2(+,6*+/*-#: ,(01+ !)%1)* ,*+$#)% D272，UUF， *!.： V U HK09028/0 a，B*b*Q*/# D，_9(28/0 D：C*4*) 810$( +0Q860+(4 ./*2#)+(/)0+#*)06JK31(R8():(40+0Q01(1： 1+0+81.*/+(,(0/ HAAA= B淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达
