《小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究（115页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 大连理上火学博士学位论文摘要本文在国内外首次报道了植酸酶基因在海水小球藻( C h l o r e l l as p M A C C C 9 5 ) 中的稳定表达。以营养丰富的海水小球藻作为生物反应器来生产植酸酶，直接作为一种无毒无害的绿色饲料添加剂，可避免复杂的提纯分离工艺，具有广阔的开发前景和潜在的经济价值。本论文首先测定了海水小球藻对1 0 种抗生素的敏感性，确定了小球藻基因工程适用的抗生素筛选标记。并以抗生素为除菌工具，获得了无菌的小球藻藻株，优化了无菌小球藻的培养条件。然后以无菌的海水小球藻完整细胞为受体，以g u s 基因作为报告基因，优化了电击转化条 件。在此基础上，将植酸酶基
2、因转入小球藻中，获得了转基因藻株。这不仅为低成本生产植酸酶，使其得以广泛应用，创造更大的经济效益和社会效益打下了基础，同时也为藻类生物反应器的建立及广泛应用开辟了道路。具体研究内容及结果如下：1 、研究了海水小球藻对1 0 种常见抗生素的敏感性及淡化培养对小球藻生长的影响，并测定了潮霉素、G 4 1 8 、氯霉素、Z e o c i n 对小球藻在海水培养基和淡化十倍培养基中的半致死剂量。实验结果表明，小球藻对卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、头孢霉素、链霉素都不敏感，这几种抗生素在实验范围内不对小球藻的生长产生明显抑制；小球藻对潮霉素较敏感，对G 4 1 8 则很敏感，对氯霉素、Z e
3、 o c i n 极敏感。淡化十倍培养对小球藻的生长没有显著影响，且能使小球藻对抗生素的敏感性大为提高。G 4 1 8 适合作为小球藻基因工程的选择试剂，其在固体培养基中的适宜筛选浓度为1 4 0 5 I _ t g m L 。2 、研究了以抗生素为除菌工具，建立小球藻无菌培养体系的途径。首先测定了小球藻培养液中的细菌对小球藻不敏感的6 种抗生素的敏感性，然后研究了适于小球藻除菌的抗生素组合和处理浓度及加入抗生素对小球藻和细菌生长的影响。结果表明小球藻培养体系中的细菌对庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素非常敏感，利用涂平板挑单克隆法去除霉菌后，将这五种抗生素均以终浓度1 0 0I
4、 _ t g m L 加入小球藻培养体系中，处理两次，获得了无菌的小球藻藻株。进一步研究了接种密度、光强、p H 和温度对小球藻生长的影响，并在无菌培养条件下，对影响无菌小球藻生长的五种主要营养因素：N a H C 0 3 、K N 0 3 、K H 2 P 0 4 、V B l 、V B l 2 进行了优化。得N d , 球藻适宜的培养条件为：初始接种浓度取藻体细胞数为4 2 7 1 0 6 个m L 左右；p H 范围在1 0 左右；培养温度为2 5 士0 5 ；光照强度约为3 O 1 0 3 1 0 1 0 4 1 x 。通过五因素四水平正交实验，得到适于无菌小球藻生长的优化培养基配方为
5、：K N 0 30 5g L 、N a I - I C 0 30 2g L 、V B l 21 0 g L 、K H 2 P 0 4O 0 2g L 、V B lO 3m g L 。该优化配方加上d 2 微量元素后具有小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究明显的生长优势。3 、鞋无菠豹海承夺薄藻完整缯熬为受体，弱斌C a v I V 3 5 S 襄动予箨为5 羔游调控元件，以f l u s 菠因作为报告基因，利用电击法将g u s 纂因转入小球藻细胞内进蠢瞬阕表达，磺究了电壹转讫条传、渗遴处理、夕 源D N A 浓度、运载D N A浓度和小球藻细胞生长时期对转化效率的影响。结果表明，
6、在5 k V 的脉冲电压、0 。0 5s 兹稼羚持续时瓣、9 e 个菰 孛簇嚣窝2 n 豹踩狰次数下魄击可获褥较衰戆转化效率；渗遴处理能恩著提商转化效率；运栽D N A 的浓度为1 5 0 p g m L 、成粒D N A 浓度为6 9 9 m L 时转亿效率最纛；两且袋子对数生长早麓验小球藻缨爨辩终源基阁有更强的吸纳能力，能获得较高的转化效率。4 、在优纯粒嘏壹条辞下，簿籀建秘含有来滚_ 予无蕊采鍪霉A f i c u u mA S 3 3 2 4 的檄酸酶基因的表达载体p B l l 2 1 p h y A I I 与无菌的海水小球藻完熬细 藏共转强，缀1 3 4 1 8 抗缝乎援簿选、P
7、 C R 检测、S o u t h e r n 杂交检测、R T - P C R 检测、槭酸酶活性检测，确认获得转植酸酶基因的小球藻藻株，且p h y AI I 基阻在 毒球藻缨黪孛歪紫转蒙莠褥翻表达。转基霞夺球藻熬蕴酸赘往覆与蠢花采灏霉A f i c u u m A S 3 ，3 2 4 的植酸酶性质比较表明，小球藻表达的植酸酶在最适作用温度 方嚣蠢穰大鬟裹，扶5 5 提嶷到6 5 ；在爨逶终月蠼上邈有较大交往。嚣个最适作用p H 值分别从p H 2 5 变为n H 3 8 ，p n 5 5 变为p H 6 0 。关毽谰；夺球藻；选择标记；无菡臻养；g u $ 基因；植酸酶蒸困大连理工大学博
8、士学位论文A b s t r a c tI ti st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h a tt h ep h y t a s eg e n eW a St r a n s f e r r e da n de x p r e s s e ds t a b l yi nC h l o r e l l as p M A C C C 9 5 , ak i n do fu n i c e l l u l a re t t k a r y o t i cg r e e nn l a r i n ea l g a e 。A e c o - r d i n gt o
9、i t sc h a r a c t e r i s t i c ，C h l o r e t t as p ，M A C C C 9 5C a l lb ea 秘醢b i o r e a c t o rf o rl a r g e s c a l ep r o d u c i n gf o r e i g np r o t e i n ss u c ha Sp h y t a s e 弧l ct r a n s f o r m a t i o no f t h i sp h y t a S eg e n ei n t ot h i s 菇艇o fa l g ac o u l db ea ne
10、 f f i c i e n tw a yt os u p p l y t h e p h y t a s e A f t e rr e s e a r c h i n g t h es e n s i t i v i t i e so f C h l o r e l l as p t o1 0a n t i b i o t i c s ，D e t e r m i n e dt h es u i t a b l es e l e c t a b l em a r k e r si ng e n e t i ce n g i n e e r i n go fC h l o r e l l as
11、 p ，T h e nb yu s i n gp r o p e ra n t i b i o t i c sm i x t u r e se l i m i n a t ea s s o c i a t e db a c t e r i ao b t a i n e da x e n i c C h l o r e l l as p a n du s i n g g u s g e n eo p t i m i z e dt h ee l e c t r o p o r a t i o nc o n d i t i o no f t h ew h o l eC h l o r e H as
12、p c e l l O nt h eb a s i so ft h eo p t i m a le l e c t r o p o r a t i o nc o n d i t i o n , t h ep h y t a s eg e n ew a st r a n s f e r r e di n t oC h l o r e l l as p 。a n do b t a i n e dt r a n s g e n i ca l g a ef o rt h ef i r s tt i m e 硝lo ft h ew o r ki nt h i sp a p e re s t a b l
13、i s h e dag o o df o u n d a t i o nt ow i d e l yp r o d u c ep h y t a s ei nl o wc o s t 。T h er e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t si nd e t a i lw e r es t a t e da sf o l l o w s ：S t u d yo ns e n s i t i v i t i e so fC h l o r e l l as p 。t o1 0a n t i b i o t i c s T h er e s d t
14、s h o w e dt h a tC h l o r e l l as p W a Sn o ts e n s i t i v et os t r e p t o m y c i n , k a n a m y c i n ，c e f a l o t h i n ，n e o m y c i n ，g e n t a m y c i na n dp e n i c i l l i n ，t h e yc a n n o ti n h i b i tt h eg r o w t ho f C h l o r e l l as p i nt h er a n g eo f e x p e r
15、i m e n t a lc o n c e n t r a t i o n I tr e l a t i v e l ys e n s i t i v et oh y g r o m y c i na n dg e n e t i c i n , a n dv e r ys e n s i t i v et oz c o c i na n dc h l o m m p h e n i c 0 1 L D s 0a n d9 5 c o n f i d e n c er a n g e so ft h e s ef o u rr e a g e n t si nb o t hs e a w a
16、 t e rc u l t u r ea n dd e c r e a s i n gN a C lc o n c e n t r a t i o nm e d i u mw e r ec a l c u l a t e dr e s p e c t i v e l y T h ec o n c l u s i o ni st h a tG 4 1 8i st h em o s ts u i t a b l er e g e n ti fu s i n gn p t l Ig e n ea ss e l e c t i o nm a r k e rf o rC h l o r e l l as p g e n e t i ce n g i n e e r i n g M o r e o v e r , t h es e l e c t i o nc o n e e r t r a t i o ni ns o l i dc u l t u r ei s1 4 0
