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1、华中科技大学硕士学位论文CAV-1对人脐静脉内皮细胞中MCP-1表达的影响姓名：杨娟申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：冯友梅20080522华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1主要英文缩略词 主要英文缩略词 AS atherosclerosis 动脉粥样硬化 MCP -1 monocyte chemoat tractant protein 1 单核细胞趋化蛋白-1 ox LDL oxidized low density lipoprotein 氧化低密度脂蛋白 HUVEC human Umbilical vein
2、 endothelial cell 人脐静脉内皮细胞 LOX1 oxidized low density lipoprotein receptor-1 氧化低密度脂蛋白受体 Cav-1 Caveolin-1 小凹蛋白-1 BSA bovine serum albumen 牛血清白蛋白 CSD Caveolin Scaffolding domain 小凹蛋白脚手架区 CBD Caveolin binding domains 小凹蛋白结合区域 LR Lipid rafts 脂质筏 Phe Phenylalanine 苯丙氨酸 Thr Threonine 苏氨酸 Src Sensitization
3、response cel 致敏反应细胞 GDP guanosine diphosphate 鸟苷二磷酸 ICAM 1 Intercellular adhesion molecule-1 细胞间黏附分子-1 VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule-1 血管细胞间黏附分子-1 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡
4、献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：杨娟 日期： 2008 年 5 月 20 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学同济医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名：杨娟 指导教师签名： 日
5、期：2008 年 5 月 20 日 日期：2008 年 5 月 20 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2CAV-1 对人脐静脉内皮细胞 MCP-1 表达的影响 CAV-1 对人脐静脉内皮细胞 MCP-1 表达的影响 中文摘要中文摘要 单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达增加是内皮功能紊乱的重要表现之一，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可以通过血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）介导内皮细胞MCP-1的表达增加，若预先加入反义LOX-1 mRNA则可抑制上述过程，表明LOX-1在介导ox-LDL诱导的内皮细
6、胞中MCP-1表达的信号转导途径中发挥重要作用。然而LOX-1的结构分析显示LOX-1胞内段无SH2域，且不与G蛋白偶联，却可激活酪氨酸蛋白激酶途径及G蛋白介导的PKC信号途径。因此，LOX-1如何介导信号跨膜转导的机制尚不清楚。由于多种信号分子聚集在Caveolae区，CAV-1是其信号转导中心,可介导多种受体的信号转导，且本课题组通过激光共聚焦检测到LOX-1与CAV-1在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）上共定位，由此我们推测，CAV-1可能协助LOX-1介导ox-LDL诱导内皮细胞MCP-1的表达增加。 本实验采用激光共聚焦技术，检测到培养的人脐静脉内皮细胞中LOX-1与CAV-1共定位。采用
7、RT-PCR和Western blot检测cav-1 mRNA及蛋白水平，以此筛选出一对有效的特异性cav-1 siRNA。在上述基础上，将培养的人脐静脉内皮细胞分为以下三组：空白对照组（正常培养基），ox-LDL刺激组（未转染特异性cav-1 siRNA）及cav-1 siRNA组（转染体外化学合成的特异性cav-1 siRNA24 h后ox-LDL刺激24 h），采用RT-PCR和ELISA方法检测MCP-1 mRNA及蛋白水平的变化。结果发现与空白对照组相比，ox-LDL刺激组MCP-1的mRNA和蛋白表达量显著增加（P0.05），表明siRNA试验中cav-1 siRNA具有特异性，试
8、验中所使用的脂质体对实验无影响。 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 图5A 凝胶电泳观察siRNA 作用后HUVEC 中CAV-1 mRNA表达水平 1 2 3：三对特异性cav-1 siRNA 4：非特异性siRNA 5：空脂质体 6.空白对照 *00.20.40.60.811.21.4123456图5B 凝胶电泳观察siRNA作用后HUVEC 中CAV-1 mRNA表达水平 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 222.2.4 特异性CAV-1 siRNA对HUVECs中CAV-1 蛋白水平的抑制效果 按上述方法转染，
9、 分组同上， 转染24h后从六孔板中提取蛋白， 用于Westernblot检测。检测结果显示（图6），三对特异性cav-1 siRNA中第1组与对照组比较蛋白水平下调(82.94 7.82) % , 差异有显著性意义( P 0.05)， 而MCP-1 mRNA表达明显上调，有显著差异( P 0.05)。与ox-LDL刺激组相比，cav-1 siRNA组沉默CAV-1后，则MCP-1 mRNA 水平显著下调 ( P 0.05)。 A B C 图7A 凝胶电泳观察HUVEC 中CAV-1及MCP-1 mRNA 水平表达变化 A：cav-1 siRNA组 B：ox-LDL刺激组 C：空白对照组 华
10、中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 24*#00.511.522.533.5siRNA组ox-LDL空白组cav-1mcp-1图7B 凝胶电泳观察HUVEC 中CAV-1及MCP-1 mRNA 水平表达变化 2.3.2 HUVECs中CAV-1蛋白水平的表达变化 Westernblot检测结果与上述RT-PCR结果一致（图8） 1 2 3 图8A Westernblot检测HUVEC中Cav-1蛋白表达水平 1：cav-1 siRNA组 2：ox-LDL刺激组 3：空白对照组 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技
11、 大 学 硕 士 学 位 论 文 25*00.20.40.60.811.21.41.6siRNA组ox-LDL空白组图8B Westernblot检测HUVEC中Cav-1蛋白表达水平 2.3.3 ELISA 检测HUVEC中MCP-1蛋白水平的表达变化 用双抗夹心 ELISA 法测定 HUVEC 中的 MCP-1 蛋白表达量（图 9）, CAV-1 siRNA 转染后 ox-LDL 刺激与对照组比较 MCP-1 蛋白表达明显下调， 差异显著 (P 0.05) , 经 ox-LDL 刺激但未转染 CAV-1 siRNA 组与对照组比较， MCP-1蛋白表达明显上调，是实验组的2.62倍，未经任
12、何处理组与对照组之间比较没有明显差异。 图9 ELISA 检测HUVEC中MCP-1蛋白水平的表达变化 *01234siRNA组ox-LDL空白组华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 263. 讨 论 3. 讨 论 动脉粥样硬化的发展被认为是类脂在内皮下间隙以修饰过的脂蛋白形式累积的过程。CAV-1几乎存在于所有与AS形成有关的细胞类型中，包括内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞，在AS形成中起着重要的作用。越来越多的数据表明, 心脏多种信号转导事件的发生是通过定位于Caveolae的细胞膜受体12。 通常情况下CAV-1在细胞膜上表现为50
13、-100nm烧瓶状内陷结构，在一定条件下可以融和形成插座样、管状等多种不同的形式。CAV-1和大多数浆膜的区别在于它有一个在形态学上的可识别的脂质亚结构， 被称为脂质筏(Lipid rafts)。 目前发现许多信号分子集中或定位在CAV-1上。这些信号分子包括Src家族酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、RasMAPK级联反应成员、NOs和酪氨酸激酶受体等，提示CAV-1可能和信号转导密切相关13。因此, CAV-1越来越多受到关注。目前已经知道CAV-1有三个独特的结构域:跨膜结构域、寡聚化结构域和脚手架结构域(CSD)。跨膜结构域由三部分组成14、15，两侧的N端和C端为亲水性氨基酸，中间为疏水性
14、氨基酸，这样就形成发夹样结构，中间插入膜内，两端则位于胞浆中，这种结构有助于将膜外信号传至膜内，寡聚化结构域是CAV-1之间或CAV-1和-2 形成同寡聚体或异寡聚体的位置，CSD目前对该结构域了解不多,只知道位于CAV-1的82-101残基和CAV-3 的55274 残基， 其氨基酸序列是cX-cXXXXc或cXXXXcXXc ( c代表一个芳香族氨基酸残基)。该序列可存在于许多信号分子，而且这一序列均位于信号分子的催化活性区，现已经明确这一序列是CAV-1和信号分子结合而发挥调节作用的部位。 由于CAV-1可能和信号转导密切相关，而LOX-1胞内段无SH2域，且不与G蛋白偶联等特性16，因
15、而本课题组开展了激光共聚焦试验，结果（见图1、图2）显示人脐静脉内皮细胞上LOX-1与CAV-1共定位， 这些结果提示在内皮细胞中LOX-1与CAV-1可能存在相互作用。 单核细胞粘附在血管内皮细胞是动脉粥样硬化发生的始动环节,粘附分子可以促进单核细胞粘附于血管内皮细胞, 这些粘附分子包括ICAM-1、VCAM-1、Eseletin（E-选择素） 以及MCP-1，其中MCP-1 在单核细胞粘附到血管内皮细胞华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 27起着重要的作用。Takahashit 等17的研究发现，MCP-1可以显著增加单核细胞粘附于血管内皮细胞。研究表明，MCP-1是一个作用极强的单核细胞趋化因子，不仅具有吸附单核细胞移动的功能，而且对血管内皮细胞黏附分子的表达亦具有调节作用18-20。Schwartz 等21证明MCP-1为作用很强的单核细胞趋化因子，具有调节血管内皮表达相关黏附分子的作用，显示其具有调节单核细胞黏附和进入动脉壁的双重功能，在单核细胞进入动脉内膜的过程中具有十分重要的作用。还有研究
