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1、2014年食源性致病菌药敏实 验操作北京市疾病预防控制中心 营养与食品卫生所 王迪抗生素的选择l选择依据临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的 药敏试验抗生素选择原则确定耐药监测的抗生 素名单。l革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗生素种类不 同革兰氏阴性菌抗生素的选择致病菌序 号抗生素名称沙门 大肠(5种) 副溶 志贺氏菌中文英文缩写1头孢 西丁CefoxitinCFX2头孢噻肟CefotaximeCTX3四环素TetracyclineTET4庆大霉素GentamicinGEN5氯霉素Chlorampheni
2、colCHL6环丙沙星CiprofloxacinCIP7萘啶 酸Nalidixic acidNAL8甲氧苄啶 /磺胺甲恶唑Trimethoprim/Sulfameth oxazoleTMP/SMZ革兰氏阳性菌抗生素的选择致病菌序号抗生素名称 中文英文缩写1苯唑西林OxacillinOXA2万古霉素VancomycinVAN3四环素TetracyclineTET4红霉素ErythromyciERY5氯霉素ChloramphenicolCHL6克林霉素ClindamycinCLI7环丙沙星CiprofloxacinCIP8甲氧苄啶 /磺胺甲恶唑Trimethoprim/Sul famethoxaz
3、oleTMP/SMZ抗生素的选择l表中推荐的抗生素为必做项目l监测手册建议各省结合实际情况增加抗生素种 类l本实验室仅选择了以上表中的抗生素,革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌各8种。检测方法CLSI推荐的体外抗生素敏感性试验方法 1.稀释法(琼脂稀释法或肉汤稀释法)琼脂稀释法常量肉汤稀释法微量肉汤稀释法 2.扩散法(disk diffusion,K-B)检测方法l食源性致病菌监测和食源性疾病监测的要求: 通过方法的统一标准化得到具有可比性的结果l手册中要求采用微量肉汤稀释法l定量测定最低抑菌浓度(MIC)检测方法-微量肉汤稀释法l实验室购置抗生素标准品,配置储存液,制备 96孔药敏板(操作复杂,不
4、同抗生素储存液的 保存条件和时限不同,手工稀释可靠性重复性 相对较差)l全自动药敏试验菌液接种判读仪(商品化药敏 板,操作简单,结果稳定,重复性好,一次可 处理大量样本,需购置仪器)l商品化的96孔药敏板(商品化药敏板,操作简 单,无需配置抗生素储存液)检测方法-微量肉汤稀释法l质控菌株的选择l革兰氏阴性菌-ATCC 25922l革兰氏阳性菌(金葡菌)-ATCC 29213实验流程-菌株活化前提:分纯的菌落 1.待测菌株和质控菌株接种BHI肉汤,37过(18-24小 时)培养。(第1天) 2.从过夜培养的BHI肉汤管中挑取菌液,划线接种BHA平 板,37过夜培养。 (第2天) 3.从过夜培养的
5、BHA平板上挑取单个菌落,再次划线接 种BHA平板,37过夜培养。(第3天) 注意:副溶血性弧菌的BHI和BHA需要含有3%的NaCl实验流程-制备菌悬液l无菌棉签挑取上述经2次活化的菌落(待测及质控) 3个,用2mL无菌生理盐水充分混匀(管壁充分研磨 )l调整菌悬液浓度为0.5麦氏单位(梅里埃的浊度计)l吸取100L菌悬液于10mLCAMHB肉汤中混匀,15min内 使用,超过15min重新配置 注意: 1.研磨不开的菌落通过涡旋震荡处理2.至少挑取3个菌落制备菌悬液,防止耐药质粒的丢失 实验流程-菌液接种药敏板l将与CAMHB肉汤混匀好的菌液接种到药敏板中l不同品牌的商品化药敏板的加样量不
6、同,按照提供的 操作说明进行操作 注意: 1.加样需使用带无菌滤芯的吸头 2.吸头不要接触孔内的冻干药粉,避免药物的相互作用 3.加样过程尽量快,30-60秒接种完毕,保持菌液的均 匀性 4.从低浓度至高浓度一次加入,减少药物的相互作用, 避免药物浓度受影响实验流程-培养l温度:361l时间 :182hl培养箱中放置水槽(盛水的烧杯),保持培养 箱中的湿度,防止加样孔中的水分蒸发。一旦 蒸发无法判读结 果。l药敏板尽量不要叠放,如果培养箱空间不够 需要叠放,药敏板叠放不要超过4个实验流程-结果判读l黑背景自然光线下肉眼观察 1.细菌生长的小孔:弥散状浑浊或小孔底部有圆 形或网状沉淀 2.无细菌
7、生长的小孔:清澈透明l无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为 MIC实验流程-结果判读注意事项l同时满足生长孔细菌明显生长,空白对照孔无细菌生 长,质控菌株的MIC值在规定的质控范围内,结果可 接受,否则重新试验lTMP/SMZ:以细菌生长数量较生长对照孔有80%或 80%以上的减少为结果终点MICl跳孔:出现单一跳孔,记录抑菌生长的最高药物浓度 ;出现多次跳孔,重复试验l商品化药敏板使用前要观察孔中的抗生素粉末是否有 洒落,如果洒落不得使用。l商品化药敏板储存在-20冰箱中,平放,标签在上实验流程-结果判读注意事项l向药敏板生产方索要抗生素浓度表和质控表l结果记录: 敏感(S)中介(I)耐药(R)商品化药敏板l天津金章(我们使用过的产品)lThermo谢 谢!联系方式: