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1、中国协和医科大学硕士论文摘要脆性x 综合征是一种最常见的遗传性智力障碍性疾病，已经证实它是由脆性X 智力低下蛋白( f r a g i l em e n t a lr e t a r d a t i o np r o t e i n ，F M R P ) 的表达缺失引起。目前已知F M R P 是R N A 结合蛋白，因此研究体内与F M R P 发生相互作用的靶m R N A s 有助于揭示F M R P 缺失和各种临床表现之问的关系。酵母三杂交系统是一种由酵母双杂交系统发展而来的，方法简单易毒亍、准确率较高，适用于在体内环境中检测R N A 雀；白质相互作用的分子生物学方法。它为我们研究R
2、 N A 一蛋白质相互作用提供了一个真核系统研究平台，从丽为这种研究提供了稳定的体内环境。我们通过构建酵母三杂交e D N A 文库，运用酵母三杂交体系分析R N A - 蛋白质相互作用，研究与F M R P 相互作用的m R N A s 。课题组已经以R N A 表达质粒p R H 5 为载体构建了1 9 周胎龄人胚海马e D N A 文库，本项工作是将文库扩增，并用酵母三杂交系统筛选人胚海马内的F M R P 靶m R N A s 。方法是将脆性x 智力低下基因F M R I 的全长e D N A克隆到p V E S 质粒中，转入I A 0 u r a 3 酵母菌株。用此质粒表达的Y E
3、S T r p 3 F M R P 融合蛋白作为“诱饵”，对上述1 9 周胎龄人胚海马e D N A文库进行筛查，筛选出在酵母体内与F M R P 发生相互作用的靶m R N A s 。在实验过程中，分数次对1 2 0 个平板上共计超过1 0 0 万个酵母克隆进行了x 唱a 1 滤纸法筛选。对x g a l 筛选过程中共1 2 2 个变蓝的菌落扩增后提取质粒，再将提取的质粒电击转化入大肠杆菌后，重新提取大肠杆菌质粒。再对获得的2 9 3 4 个质粒样本分别进行双向测序，并用b l a s m ( N C B t ) 对所测得的插入片段的核酸序列进行比对分析。共发现了5 0 种不同的e D N
4、A 序列，其中1 8 种可能与神经发育相关。我们选择了其中2 个序列4中国协和医科大学硕士论文相对应的c D N A 克隆，通过反转化验证，W e s t e r n B 1 0 t 和电泳迁移率分析等体外试验进一步验证其与F M R P 的结合。通过试验，证实了酵母三杂交系统是一种简单有效的、验证R N A 蛋白质之间相互作用的实验方法。F M R P 作为一种R N A 结合蛋白，是可以与多种与神经发育相关的，在翻译、转录及细胞分化等多种生理过程中发挥重要作用的m R N A 发生相互作用。而它们之间的这种相互作用与脆性x综合征发病的分子基础密切相关。中国协和医科大学硕士论文A b s t
5、 r a c tL o s so fF M R P ( f r a g i l eXm e n t a lr e t a r d a t i o np r o t e i n ) l e a d st of r a g i l eXs y n d r o m e ，t h em o s tc o m m o nf o r mo fi n h e r i t e dm e n t a lr e t a r d a t i o n F M R Pi saR N A b i n d i n gp r o t e i n S ow eh a v et od e f i n et h et a r g
6、e tm R N A si n t e r a c t i n gw i t hF M R Pi nv i v oi no r d e rt or e v e a lt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea b s e n c eo fF M R Pa n dv a r i O U Se l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n s Y e a s tt h r e e - h y b r i ds y s t e mi sar e s e a r c hm e t h o dd e r i v e df
7、 r o mt h a to fy e a s tt w o h y b r i ds y s t e m I tp r o v i d e sat e c h n i cp l a t f o r mw i t has t a b l ei nv i v oe n v i r o n m e n tf o rt h er e s e a r c ho f t h e s ei n t e r a c t i o n si ne n k a r y o c y t e W ec a nf o r mae D N Al i b r a r yt oa n a l y z eR N A - p r
8、 o t e i ni n t e r a c t i o n s ，a n dc a r r ya l o n gr e s e a e ht of i n dm R N A si n t e r a c t i n gw i t hF M R P Ac D N Al i b r a r yo ff e t a lh i p p o c a m p u sa tt h ea g eo f1 9w e d sw i t ht h ep l a s m i dn a m e dp R H 5 h a sb e e nf o r m e df o ry e a s tt h r e e - h y
9、 b r i ds y s t e m T h ep u r p o s eo ft h ew e s c I l tw o r ki st oe n l a r g et h es i z eo fc D N Al i b r a r y , a n du s et h ey e a s tt h r e e h y b r i ds y s t e mt os c r e e nt h et a r g e tm R N A so fF M R Pi n f e t a lh i p p o c a m p u s W h o l el e n g t he D N Ao fF M R l
10、w e r er e c o m b i n e di n t op Y E Sp l a s m i d s ，a n dt h e nt r a n s f e r r e di n t oL 4 0 - u r ay e a s ts t r a i n s T h ef n s i o n e dp r o t e i ne x p r e s s e db yt h ep Y E Sp l a s m i d sw e r eu s e da st h e b a i t t os c r e e nt h el i b r a r yt of i n dt h et a r g e
11、 tm R N A si n t e r a c t i n gw i t hF M R Pi nt h ey e a s tc e l l s M o r et h a n1m i l l i o nc l o n e sh a v eb e e ns c r e e n e do n1 2 0p l a t e sb yt h eX - g a lf i l t e rp a p e rs c r e e nm e t h o d ，a n dh a v ee x t r a c t e dp l a s m i df r o m1 2 2c l o n e sr e v e a l i
12、n gp o s i t i v er e s u l ti nt h eB - g a l a c t o s i d a s es c r e e n T h e nt h ep o s i t i v ec l o n ep l a s m i d sw e r et r a n s m i t t e di n t oT O P l 0e c o l t ，a n dr e e x t r a c t e df r o mt h e m 2 9 3 4p l a s m i ds a m p l e sw e r eo b t a i n e da n ds e q u e n c e
13、 da n a l y s i z e dw i t ht w o6中国协和医科大学硕士论文p r i m e r sr e s p e c t i v e l y , a n dt h es e q u e n c e sa n a l y z e dw i t hb l a s t e n ( N C B I ) U pt on o w , 5 0t a r g e tm R N A sh a v eb e e nf o u n dt h a ti n t e r a c tw i t hF M R P | 18t a r g e tm R N A sm i g h tb er e l a
14、 t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fn e r v a ls y s t e m 2o ft h ee D N Al i b r a r yp l a s m i d sh a v eb e e nc h o s e na n dc l o n e dt ov a l i d a t ew i t hr e v e r s et r a n s m i t ，W e s t e r n - B l o t ，a n de l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d st ot e s t i f yt h ei n t
15、e r a c t i o nb e t w e e nt h e s eR N Aa n dF M R PT h r o u 【g ht h ea b o v em e n t i o n e dp r o c e s s ，i th a sb e e ni d e n t i f i e dt h a tt h ey e a s tt h r e e h y b r i ds y s t e mi sas i m p l ea n de f f i c i e n tm e t h o di nv a l i d a t i n gt h ei n t e r a c t i o nb e
16、 t w e e nR N Aa n dp r o t e i n A saR N Ab i n d i n gp r o t e i n ，F M R PC a ni n t e r a c tw i t hm a n ym R N A sa c t i n ga sak e yr o l ei nt r a n s l a t i o n ，t r a n s c r i p t i o na n dc e l ld i f f e r e n t i a t i o np r o c e s s T h e s ei n t e r a c t i o n so r ec l o s e l yc o r r e l a t e dw i t ht h em o l e c u l a rf o u n d a t i o no ff r a g i l eXs y n d r o m e 7中国协和医科大学硕士论文月I J舌脆性x 综合征是人群中最常见的遗传性智力低下疾病，细胞遗传学分析显示与X 染色体长臂
