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1、?综述与专论?生物技术通报 BIOTECHNOLOGY? BULLETI N2009年第 10期基因工程抗体研究进展李菁林彤宋帅高闪电邵军军丛国政独军政常惠芸(中国农业科学院兰州兽医研究所 国家口蹄疫参考实验室 家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室, 兰州730046)? ? 摘? 要: ? 随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究, 利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能, 进而开发了新的抗体应用领域, 使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子, 可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性, 去除
2、或减少无关结构, 从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。关键词: ? 基因工程抗体人源化抗体小分子抗体核糖体展示Advances in Genetic Engineering AntibodyLi Jing? L in Tong? Song ShuaiGao ShandianShao JunjunCongGuozhengDu Junzheng? ChangHuiyun(K ey Laboratory ofAni malVirology ofM inistry ofAgriculture , S tateK ey Laboratory of Veterinary E tiologicalB
3、iology,NationalFMD R eference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute , ChineseAcademy of AgriculturalSciences , Lanzhou 730046)?Abstrac:t? W ith the development of research inmolecular biology and structure , function of antibody , antibody was rebuild by celland genetic engineering and h
4、ad a new function, thereforeitwas applied inmany fields , which attribute the developmentofmonocle anti ?body . Genetic engineering antibody was reasse mbled under design, which reserve and increase the specificity and biologic activity ofnat?ural antibody , remove and decrease the irrespective stru
5、cture , getting rid of the defection ofmonocle antibody in clinical application.Key words :? Genetic engineering antibodyHumanized antibodyM icro molecular antibodyR iboso me display收稿日期: 2009?04?23 基金项目: 国家科技支撑计划 ( 2006BAD06A14 , 2006BAD06A10) 作者简介: 李菁 ( 1983?), 女, 在读硕士, 研究方向: 分子病毒学; E? mai: l lj w
6、y831114 163 . com 通讯作者: 常惠芸 ( 1965?), 女, 博士, 研究员, 主要从事口蹄疫病毒分子生物学和免疫学研究工作; E? ma i:l changhuiyun 126 . com? 抗体在生物医学领域中的应用极为广泛, 其制备技术经历了从多克隆抗血清、 单克隆抗体到基因 工程抗体等 3个发展阶段。1975年, Kohler和 M l?stein建立了体外细胞杂交融合的杂交瘤细胞, 产生了仅针对某一特定抗原决定簇、 纯度很高的单克隆 抗体。由于单克隆抗体的高度特异性, 使其在细胞生物学、 基础医学、 临床诊断及其他领域得到广泛应用。但同时单克隆抗体也存在一些缺陷,
7、 如完整抗体分子大, 大部分抗体是鼠源性抗体, 应用于人体会 产生抗鼠抗体反应 (HAMA)等, 因而妨碍了其在临床上的应用。为了克服大分子单克隆抗体的缺点,人们利用基因工程技术制备了人鼠杂交和完全人源化的抗体, 减少抗体中的鼠源成分, 尽量保留原有抗体的特异性, 此技术主要是将免疫球蛋白基因结构 与功能同 DNA重组技术有机结合起来, 在基因的水平上将免疫球蛋白分子进行重组后导入转染细胞后表达, 这类抗体被称为第三代抗体。基因工程抗体 是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体,主要包括两部分: 一是对已有的单克隆抗体进行改造, 包括单克隆抗体的人源化 (嵌合抗体、 人源化抗体 )、 小分子
8、抗体 ( Fab , ScFv , dsFv, diabody , min ibody等 )以及抗体融合蛋白的制备; 二是通过抗体库的构建, 使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。2009年第 10期李菁等: 基因工程抗体研究进展1人源化抗体1 . 1嵌合抗体 嵌合抗体 ( chi m eric antibody)属第一代人缘化抗体, 有 60 % 70 % 的人源区域, 是目前研究较多且较为成熟的基因工程抗体, 它是应用 DNA重组技 术将鼠源单抗的 V区基因与人免疫球蛋白的 C区基因相连接, 构建成嵌合基因, 插入适当质粒, 转染相应宿主细胞表达产生的。其中可变区具有结合抗 原
9、的功能, 而恒定区则具有抗体效应功能、 免疫原性和种属特异性。嵌合抗体的 Fc段可补充细胞毒效应分子功能 1, 并可延长抗体在血清中的半衰期。这种技术保留了完整的鼠单抗可变区序列, 其亲和力和特异性都得到了保证, 但也保留了鼠可变区的异源性, 仍可能诱导产生 HAMA。 1 . 2CDR移植抗体CDR移植抗体 ( CDR?grafted antibody) 是 20世 纪 90年代发展起来的一项新技术, 是在嵌合抗体的基础上, 利用基因工程技术用人的 FR替代鼠 FR形成更为完全的人缘化抗体, 即除了 3个 CDR是鼠源 的外, 其余全部是人缘结构, 属第二代人缘化抗体。但单纯 CDR移植难以
10、保证亲本鼠单抗的亲和力和特异性得到再现, 因为具有支持作用的 FR不仅为 CDR的构想提供了环境, 有时还参与抗体位点正确构象的形成, 甚至参与抗原的结合 2。因此该技术需要考虑两方面的问题: 选择合适的人类受体模板 和识别插入人源抗体的鼠源模板上的关键残基。最常用的方法是选择与鼠源抗体有高同源性的人源抗体。另有研究人员在此基础上还进行了表面氨基酸 残基人源化和表位印模选择工作, 以降低其免疫原性。CDR移植抗体是人源化中最常用的策略。 2小分子抗体2 . 1单链抗体 单链抗体 ( single chain antibody , scFv)是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段, 分子量约
11、为完整抗体分子的 1/6 , 是用基因工程方法将抗体 重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白, 在大肠杆菌中表达成一单链多肽, 并在细菌体 内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体。与抗体分子相比, scFv在药代动力学上表现出了更好的组织穿透力, 用于治疗时可进入一般抗体不能达到的部位。同时, 由于抗原结合面不变, 抗 体片段拥有全部结合特异性。单链抗体的独特之处在于其多肽接头, 多肽接头可设计为具有特殊功能的位点, 如金属螯合、 连接毒素或药物等, 以用于影像和临床治疗。单链抗体优越性在于可通过包含体 大量表达、 易于基因工程操作, 尤其易于构建抗体融合蛋白, 具有分子小
12、、 免疫原性低、 无 Fc端、 不易与具有 Fc受体的靶细胞结合、 对肿瘤组织的穿透力强 等特点, 可作为药物、 毒素、 放射性核素、 细胞因子导向肿瘤的有价值分子。2 . 2双特异性单克隆抗体 双特异性单克隆抗体 ( bispecificmonoclonal anti?bodies , BsAb , 双抗 )是通过化学偶联、 细胞工程 (双杂交瘤细胞 )和基因工程方法制备的一种单克隆抗 体的特殊类型 3。它有两个抗原结合位点, 可分别结合两种不同的抗原表位, 即结构上双价、 功能上单价。它实际是一种杂交分子, 两条 H 链之间与两条L链之间的结构不同, 两个 Fab片段也不同。早期 的双特异
13、性抗体是用化学重组法制备, 量少且活性较低。1983年, M ilstein等在单克隆抗体的原理上进一步运用杂交? 杂交瘤技术, 以生物学方法制备出 双特异性单克隆抗体。该抗体其中一个臂可与靶细胞表面的抗原结合, 另一个臂则可与效应物 (如药物、 效应细胞等 )结合, 从而直接将效应物导向靶组 织细胞。研究发现, 这种靶向作用不受特异性受体和靶细胞上 MHC?类分子及其刺激分子参与等约束, 且当肿瘤细胞不存在时, 效应细胞不被激活 3。2 . 3二硫键稳定抗体 二硫键稳定抗体 ( disulfied?stablized Fv , dsFv)是在单链抗体的基础上发展起来的一类新型基因工程抗体,
14、它是将抗体重链可变区 ( VH)和轻链可变区 ( VL)的各一个氨基酸残基突变为半胱氨酸, 通过链间二硫键连接 VH和 VL可变区的抗体 4。通用的突变位点是重链的 44位和轻链的 100位或重链的 105位和轻链的 43位。 dsFv最显著的优点是生化性质稳定, 能够耐受环境条件的剧烈作用。2 . 4?Fab片段 将重链 Fd基因与完整的轻链基因 5? 端接上细菌的信号序列, 所表达的蛋白在细菌信号肽的引导下可分泌到周质腔, 信号肽被信号肽酶所裂解, 生成的 Fd41生物技术通报 Biotechnology? Bulletin2009年第 10期段和轻链在周质腔中完成立体折叠和链内、 链间二
15、硫 键, 形成异二聚体, 成为有功能的 Fab 。这种小分子抗体具有抗体的活性, 其大小为完整 IgG的 1/3 。另外, 因其不含有 Fc段、 分子量小、 免疫原性低, 穿透力 强, 可与多种药物及放射性同位素偶联, 多用作导向药物的载体和显影。但其主要在原核细胞内表达, 折叠性有待解决; 且仅有 1个抗原结合位点, 与抗原的亲和力低, 故在肿瘤治疗上有其优越性 5。3某些特殊类型的抗体3 . 1? 双功能抗体双功能抗体 ( bifunctional antibody, BfAb)经人工设计构建的双特异性抗体由两个不同的抗原结合位 点组成, 将一种抗体分子与另一种功能分子, 如药物、 酶或放
16、射性核素结合, 使功能分子导向靶部位,并激发具有导向性的免疫反应, 又称为双功能抗体。 3 . 2抗原化抗体抗原化抗体 ( antigenized antibody , AbAg)是把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链 CDR3序 列中进行表达, 从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体。3 . 3内抗体 细胞内抗体 ( intrabody)主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体, 亦称内抗体, 其中gp120的 Fab段和抗 Tat ScFv已进入临床试用。3?4? 抗体酶 抗体酶 ( Abzyme)是抗体与抗原非共价键结合,作为表位的抗原是低能态分子, 结构稳定。酶与底物以疏水作用为主, 但底物为高能态分子, 不稳定。 抗独特型 b2B可以模拟底物表位, 诱导产生抗体分子, 当它作用与底物时, 引起底物分解或其它改变。由于酶分子易失活, 抗体酶本质是抗体, 分子相当稳 定。用它来代替酶促进化学反应, 能简化程序, 带来可观效益, 现已研制出分支酸盐变位酶、 脂酶和肽酶的抗体酶, 催化反应良好。此外, 通过基因工程、 蛋 白质工
