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1、细胞工程细胞工程是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用 或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术细细 胞工程的应用（在现代生物技术中的地位）胞工程的应用（在现代生物技术中的地位）细胞工程是现代生物技术的基础。细胞是大部 分生命体存在的基本结构，而现代生物技术（如基因工程 蛋白质工程等）无不是对细胞或 细胞的物质进行改造而达到获取目的产物影响生物什么状态的目的，在这里，细胞都是这 些技术开展的平台和基础无菌技术无菌技术灭菌方法：物理灭菌法、化学灭菌法、使用抗生素。物 理方法：干热、湿热、射线/微波/紫外线处理、过滤、离心沉淀、大
2、量无菌水冲洗等。化 学方法：各种灭菌剂。抗生素的使用：青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等，主要用 于细胞培养过程中细胞冷冻方法细胞冷冻方法：1.缓慢冷冻法将处于 0C 或其他预处理温度的材料 以 12C/min 的降温速度从起始温度降到-100C，稳定 1h 后投入液氮中保存或以此降温 速度连续降温至-196C。按 1mL 每安瓿的量分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。将封口 的安瓿放入慢冻机内，添加保护剂的细胞悬液按照一定梯度降低温度进行缓慢冷冻。当温 度在-25C 以上时，可以按照 12C/min 的梯度降温；当温度达-25C 以下时，可以按 照 510C/min 的梯度降温。2.预冷冻法
3、包括两步冷冻、逐级冷冻两种，前者是将预 处理后的材料先通过缓慢冷冻法降温至-40C，保存一段时间（约 30min）后，再投入液 氮中保存。后者将经过预处理的材料先制备成不同温度等级的溶液，如-10C、-15C、- 23C、-35C 及-40C，并在每级温度中停留一定时间（46min） ，然后将材料投入液氮 中保存。3.快速冷冻法将材料从 0C 或者其他预处理温度直接投入液氮中保存。关键 就是利用高速降温越过冰晶增长的问下哦温度区，使细胞内来不及形成大小可以致死细胞 的冰晶。细胞培养的操作方式细胞培养的操作方式 1.分批式培养：是指细胞和培养基一次性加入到培养容器或 生物反应器内进行培养，在培养
4、过程中培养液体积不变，不添加营养成分，待细胞增长和 产物积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物和培养液的培养方法。2.流加式培养：是 指在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种营养成分的培养方法。3.半连续式培 养：又称重复分批式培养或换液培养。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间从 中取出部分培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原有体积，使 生物反应器内的总体积不变。4.连续式培养：在细胞达最大密度之前，一定速度向生物反 应器连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养液以相同的速度连续从生物反应器流出， 以保持培养体积恒定的培养方式。5.灌流式培养：是把细胞和培养基
5、一起加入生物反应器 后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分培养液取出，同时又连续不断地补充新 的培养液植物无性繁殖过程中器官发生方式植物无性繁殖过程中器官发生方式：1.不定芽型 2.器官型 3.器官发生型 4.胚状 体发生型 5.原球茎型原球茎原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官， 可萌发成苗植物组培基本过程植物组培基本过程：1.准备实验器材和培养基 2.采集植物材料 3.外植体消毒 4.接 种外植体 5.控制条件培养及继代培养 6.组培苗的炼苗移栽植物组培操作中的注意事项植物组培操作中的注意事项一， 玻璃化：试管植物的半透明畸形现象，又称过度水化现象。二，褐变：
6、主要是由多酚氧化 酶引起的酶促褐变。1.外植体的选择与处理：选生长旺盛者，灭菌与切割时要尽可能减小 损伤 2.培养条件：如酸性环境下通常不易褐变 3.细胞的筛选和材料的预处理：剔除易褐变 的细胞；易褐变的外植体可在黑暗条件下培 4.养一段时间，再连续转移几代，可减轻褐变 5.加入抑制剂：抗氧化剂等 6.加入吸附剂：如活性炭、聚乙烯吡咯烷酮等。三，微生物污 染：外源菌和内源菌 1.加入抗生素 2.严格的无菌操作 3.外植体的预处理及消毒方法的改 进 4.使用间隙消毒法处理体细胞胚体细胞胚又叫胚状体，是指立体培养条件下没有经过受精过程而 形成的胚胎类似物人工种子人工种子又称合成种子或体细胞种子，将
7、植物离体培养产生的胚状体或 芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒植物脱毒方植物脱毒方 法法：物理、化学和生物 3 种方法植物脱毒鉴定方法植物脱毒鉴定方法 1.直接检测法 2.指示植物法 3.电镜法 4.抗 血清检测法 5.分子检测技术试管动物培育过程试管动物培育过程 1.精子采集与体外获能，卵子采集与成熟培 养 2.体外受精 3.重组胚激活与体外培养 4.胚胎移植 5.体内发育、出生超数排卵技术超数排卵技术是指 在发情周期的适当时间，用人工方法促使动物有更多的卵泡发育、成熟并排卵的一项技术 胚胎分割胚胎分割是指借助显微操作仪切割早期胚胎成多等份，再移植给受体，从
8、而制造同卵多仔 后代的技术，是一种广义上的动物克隆技术试管婴儿试管婴儿是指将卵子与精子取出在体外受精， 培养发育成早期胚胎，再植回母体子宫内发育出生的婴儿，也就是采用体外受精联合胚胎 移植技术培育的婴儿。第一代：斯蒂普特和爱德华兹创造的试管婴儿。将精子与卵子通过 共培养完成受精。第二代：采用显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内受精培育的婴儿。第三代：经过种植前遗传学诊断培育出的试管婴儿 人工受精与体外受精区别人工受精与体外受精区别体外受精：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育 到一定程度，通过胚胎移植移入受体完成发育的动物。人工受精：是指将采集的精子注入 发情处理的母体内完成受精过程克
9、隆克隆本意是指遗传性状完全相同的分子、细胞或来自同一 生物个体的无性繁殖群体。广义：包含基因水平、细胞水平、胚胎水平、个体水平上的复 制。狭义：纯粹的无性繁殖方式细胞核移植细胞核移植是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核 移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术核质杂种核质杂种是一种具有来源于不同种或不同 系统的核与细胞质所形成的杂种胞质杂种胞质杂种将两种来源不同的核外遗传物质（细胞器）与一 个特定的核组合在一起得到的细胞是胞质杂种细胞重组细胞重组是指从活细胞中分离出细胞器及其 组分，在体外进行重新装配称为具有生物活性的细胞的一种技术胞质杂种胞质杂种将两种来源不同 的核外遗传物质（细胞器）
10、与一个特定的核组合在一起得到的细胞是胞质杂种对称融合对称融合两 个完整的细胞间的融合不对称融合不对称融合利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与 另外一个完整的细胞进行融合细胞融合方法细胞融合方法 1.生物法：病毒诱导细胞融合主要是由于病毒 会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的 交流，进而达到细胞融合的目的 2.化学法：是指采用化学诱导剂促使细胞融合的方法 NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合钙离 子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高 pH 能改变质膜的表面电荷，
11、利于细胞融合 3.物理法：最常采用的物理有道细胞融合方法是 电融合诱导法，是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生 可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。一般经过聚集、细胞膜融合、异核体、融合细胞 4 个阶段融合细胞筛选的方法与原理融合细胞筛选的方法与原理 1.抗药性筛选系统：利用细胞对药物敏感性差异筛选融 合细胞 2.营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时不能生长繁殖，即属于营 养缺陷型细胞。利用两亲本细胞营养互补作用原理可以筛选融合细胞 3.温度敏感突变型融 合细胞的筛选：一般的细胞能在 340C 的温度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能 在高温或低温下生长
12、，由此可筛选融合细胞 4.物理特性筛选法：利用细胞在形态、大小、 颜色上的差别可以在倒置显微镜下用微管将融合细胞吸取挑选出来。也可以采用离心方法 分离融合细胞 5.荧光标记法：对于在形态、颜色上都不能区分的情况，可以采用不同的荧 光染料分别标记两个亲本细胞，这样融合细胞内存在两种荧光标记，可以在荧光显微镜下 挑选分离或用流式细胞仪分离非整倍体非整倍体染色体组不是单倍体染色体数整倍数的细胞或个体。 体细胞核中，染色体组不是一倍体的整倍数，而是比正常染色体数多了或少了一个或几个 染色体单倍体特征单倍体特征单倍体的基本性状虽然和二倍体相同，但一般比较矮小纤弱。植物的单 倍体几乎都不能形成种子。由于单
13、倍体中没有同源的染色体，所以在减数分裂时仅仅出现 一价染色体，它们分向二极；不过也有全部一价染色体移向一极仍旧保持完整的染色体组， 这时就能形成有功能的配子，产生种子；但是多数情况下由于子细胞内含有的染色体组不 完全，所以也就成为高度不育的原因多倍体产生途径多倍体产生途径：同源多倍体和异源多倍体的形成过 程基本相似，主要通过两条途径：第一，原种或杂种所形成未减数配子(即配子内保持原种 或杂种的合子染色体数)的受精结合；其二，原种或杂种的合子染色体数加倍。多倍体不仅 可以自然发生，也可以通过上述途径人为地创造多倍体。据估计，多倍体的自然发生主要 是通过第一条途径，而人工创造多倍体则主要是通过第二
14、条途径雌核发育雌核发育精核进入卵细胞 后未与卵核融合而退化，卵核未经受精而单独发育成单倍体胚胎嵌合胚胎嵌合也称胚胎融合，是指 将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成 一个胚胎，然后移植到受体母畜体内继续发育成嵌合体后代的技术植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点 1. 细胞体积大 2.通常以非均相细胞团的形式存在 3.有细胞壁和大液泡，易被剪切力损伤 4. 生长慢，周期长 5.培养基复杂，易污染 6.需要光照和通气看护培养看护培养用一块活跃生长的愈伤 组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖饲养层培养饲养层培养用处理过的（如 X 射线处理）无分 裂能力或分裂
15、很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长固定化培养方法固定化培养方法是指将 游离的细胞包埋在支持物内部或表面，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术两相培两相培 养养是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养 体系形成上下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出来后转移至有机相中 动物细胞体外生长特点动物细胞体外生长特点 1.体积较大，无细胞壁，对搅拌敏感 2.生长缓慢，易受污染 3.不 需光照，需氧量少 4.易形成聚集体，大多需要贴壁生长 5.原代细胞易退化、死亡，只有癌细胞和转化细胞可无限增殖影响培养细胞的条件影响培养细胞的条件 1.环境无毒
16、和无菌 2.适宜的温度：人和哺乳动物培养细胞最适温度均 为 3537。3.气体环境和氢离子浓度：需要一定量的 O2（19959975pa）和 CO2（95 空气+5%CO2） ；pH7.2-7.4。4.渗透压：260320mOsm/kg（渗透压 osmotic pressure） ，适 用于大多数细胞。5.营养物质：六碳糖是主要的能源物质，还需要 12 种基本氨基酸和谷胺 酰胺等单层贴壁培养单层贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养动物细胞小规模培养方法动物细胞小规模培养方法 1.悬滴培养法 2.灌注小室培养法 3.培养板培养法 4.转管培养法 5.培养瓶培养法传代培养传代培养： 是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程细胞系细胞系是由原代培养经传代培养纯化，获得的 能在体外生存的细胞群体细胞株细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或 通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群区别区别：初代培养物开始第一次传代培养后的 细胞，即称之为细胞系。从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的
