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1、胚胎分割技术的简述胚胎分割技术的简述胚胎分割（Embryo bisection）是指借助显微操作技术或徒手操作方法 切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多 胎的生物学新技术。 由于来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此 胚胎分割可看成动物无性繁殖或 克隆的方法之一 【1】 。胚胎分割技术可用于 扩增可用的优良胚胎的数目和生产同卵双胎、同卵多胎的克隆动物，可用于濒 危动物的保护，也可为早期胚胎遗传疾病的检查和性别鉴定等技术提供一种活 体组织检查的方法。一、胚胎分割的研究概况 早在1904年，Spemann就进行了蛙类2细胞胚胎的分割实验，并获得同卵双 生后代。20世
2、纪30年代，Pincus等首次证明2细胞兔胚的单个卵裂球在假孕受体 兔体内可发育为体积较小的胚泡。哺乳动物胚胎分割技术始于Nicholas( 1942) 对大鼠22细胞胚胎卵裂球的分离和培养研究。其后,1959 年Tarkow ski【 2 】 研究了小鼠1/4 ,2/4 ,3/4 卵裂球的发育规律,得到了世界上首例半胚来源的活 体动物。20世纪70年代以来，随着胚胎培养及移植技术的发展和完善，哺乳动 物胚胎分割取得了突破性进展。1979年，Willadsen等通过分离2细胞胚胎的卵 裂球，也获得绵羊同卵双生后代。20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术 进人快速发展时期。1998 年,Rh
3、o 等【3】又利用卵母细胞体外培养成熟、体外 受精的方法获得了牛胚胎,移植12 枚四分胚给6 头受体,获得2 头四分胚的犊牛,这 是第一次利 用体外胚分割得到活体后代。当然,胚胎并不是随着分割次数的增 加,产生的克隆动物就越多。如果超过四分割以上则产生的克隆动物个体数可能 反而减少,甚至一个也得不到。为了使胚胎分割技术更便于在生产中推广应用, 一些学者开始对这种显微操作技术加以改进,简化其方法并避免使用昂贵仪器, 而采用在体视显微镜下徒手操作的简易方法进行胚胎分割。1988 年Williams 用止血钳夹住用刮胡刀片制成的显微手术刀片分割7龄牛胚得到了同卵双生牛犊 【4】。 我国家畜胚胎分割及
4、相关的研究工作，自20世纪80年代晚期以后进展也很 快。1986 年窦忠英等【5】得到了国内首批分割胚牛犊(单生) ,该实验将分割 所得的半胚装入透明带后移植受体与裸胚直接移植受体的产仔率均为25 %。谭 丽玲等（1988年）对兔胚胎进行了半胚分割，并获得仔兔【6】 。1989年，江苏 农科院、中科院遗传所获得山羊鲜胚分割羔羊；同年，张涌等也获得了山羊鲜 胚和冻胚分割羔羊；此外，我国的研究人员也把胚胎分割与胚胎性别鉴定有机 结合，推动了胚胎分割的深人研究和推广。二、胚胎分割原理 早期实验胚胎学的研究发现,大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育,即去 掉一个早期胚胎的一半,剩余的部分可以调整其发育方
5、向,仍可以发育为一个完整的胚胎。反之,若把两个早期胚胎融合在一起,它们不是发育为两个连在一起 的胚胎,而是在细胞间重新调整,仍发育为一个胚胎。但随着发育进程,其调整能 力逐渐减弱,细胞的组织发育方向变得越来越固定,直到调整能力完全丧失。 早期的实验胚胎学证明哺乳动物2细胞期的每个卵裂球都具有发育为正常胎 儿的“全能性”。对小鼠胚胎分割的实验认为,在32 细胞期的胚胎仍具有调整 能力,但到64 细胞期的胚胎就逐渐失去这种能力。到神经轴时期的胚胎,再分割 为两半,就永远不会发育为正常的胚胎了【4】。三、胚胎分割方法 1、毛细管吹吸法 该方法主要适用于分离2细胞到8细胞期卵裂球。在显微操作仪的帮助下
6、,在 无钙、镁离子的培养液中,用固定针吸住胚胎,用另一玻璃针挑开胚胎的透明带, 细胞团自透明带中脱出。再用仅能通过胚胎的毛细管吹吸胚胎,得到单个卵裂球,再 将卵裂球装入空的透明带中,体外培养至一定时期,移植入受体中。 2、徒手分割法 该法主要适用于分割体积较大的胚胎,其优势在于可以不用显微操作仪。在 立体显微镜下,用止血钳夹住切割刀片,将透明带切开一部分,再用直径略小于胚 胎的毛细管吹吸几次,胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。 这种方法多用于分割桑葚胚和囊胚。 3、显微手术法 这种方法主要适用于分割桑堪胚和囊胚。在显微操作仪的帮助下,以固定针 吸住胚胎,用玻璃针或显微手术刀将
7、胚胎对称切割。在切割桑葚胚时,需要在不 含钙、镁离子的培养液中,以降低细胞间的连接,降低由于切割造成的损伤。对 胚胎的分割要注意对称,尤其是囊胚,要注意将内细胞团对称地一分为二。但这 种方法与徒手分割相比无论切割有效率还是移植产羔率都是最低的。并且玻璃 针带内切割需要昂贵的显微操作系统,因此这种切割方法在实践中很难得到推广 应用【7】。 4、酶消化法去透明带后分割法 5、免疫手术法四、胚胎分割操作流程 胚胎分割可在哺乳动物2细胞期至胚泡期的胚胎进行。主要由胚的采收、用 显微手术进行胚的分离、分离胚（裂球）的培养、分离胚的移植等4步组成。胚胎获取手术法：开腹从输卵 管中获取 28 细胞期 胚胎非
8、手术法：经阴道、 宫颈插管，从宫腔内 冲洗晚期胚胎胚胎分割分割胚的培养 体外培养体内培养分离胚的移植五、胚胎分割技术的应用及意义 利用胚胎分割技术,取出着床前胚胎的单个卵裂球或取出滋养层细胞的一 部分进行生化检验、PCR 扩增和性别鉴定以检测蛋白质或酶水平的生化缺陷、 特定基因的缺失及伴性遗传病,以便在着床前决定是否终止妊娠,这对于优生优 育有重要意义。世界首例胚胎分割-性别鉴定试管水牛在广西水牛研究所水牛 场出生【10】。胚胎分割技术经过近20年的发展,在理论和技术方法上都已经日 趋完善, 对畜牧业生产和试验研究有着特殊的作用,尤其是对大型农场动物进行 良种繁殖时,可用胚胎分割方式增加胚胎数
9、目及人造同卵双胎和多胎数目,移植 后便可获得更多的良种。哺乳动物胚胎冷冻保存技术与胚胎分割技术结合,可以 增加胚胎数目和提高产犊率, 同时在加速家畜育种改良进程、建立基因库、保 护资源等都有重要的意义。六、参考文献【1】 Nicholas J S,Hall B V.Experiments on developing rats.II.The devel- opment of isolated blastomeres and fused eggs J.ExpZool,1942,90:441. 【2】Tarkowski K A. Experiments on the development of i
10、solated blas- tomeres of mouse eggs J.Nature,1959,184:128621287. 【3】Oho GJ , Johnson W H ,Hetteridge KJ.Cellular composition and vilbility of demiand quarterembryos made from bisected bovine morulae arid blas- tocysts produced in vitro J.Theriogenology,1998,50:8852895. 【4】陈品健.普通动物学M.北京:科学出版社,2001,P:
11、461. 【5】窦忠英,樊敬庄,张致民,等.奶牛胚胎切割试验报告J .西北农业大学学 报,1987,15(3):19224. 【6】桑润滋，靳胜新，陈兆源，赵纳孚，潭丽玲.奶牛新鲜和冷冻胚胎分割移 植试验J中国畜牧杂志，1993，29（4）：68 【7】应璐祺,王争光,俞颂东.山羊早期胚胎切割技术比较试验J.上海畜牧兽 医通讯,2006,4:24225. 【8】 Williams T J，Elsden R P，Seidel G E. Pregnancy rates with bisected bovine embryosJ.Theriogenology，1984，22（5）： 521531 【9】金方，侯云鹏，周光斌，赵学明，朱士恩小鼠胚胎徒手分割技术的研究 J中国实验动物学报，2004，12（2）：119123 【10】李萌.世界首例胚胎分割性别鉴定试管水牛在广西诞生J.山西农业 (畜牧兽医),2008,10:053.
