无菌、微生物限度检查及方法验证

《无菌、微生物限度检查及方法验证》由会员分享，可在线阅读，更多相关《无菌、微生物限度检查及方法验证（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、无菌、微生物限度检查 及方法验证微生物实验室的质量管理一、实验室设施与设备和管理（法规要求）无菌检查、微生物限度检查与抗生素微生物检定的实验室，应严格分开 。 无菌检查、微生物限度检查实验室分无菌操作间和缓冲间。无菌操作间应具备相应的空调净化设施和环境，采用局部百级措施 时，其环境应符合万级洁净度要求。进入无菌操作间应有人流净化和物流净化的设施。无菌操作间应根据检验品种的需要，保持对邻室的相对正压或相对 负压，并定期检测洁净度。无菌操作间内禁放杂物，并应制定地面、门窗、墙壁、设施等的定 期清洁、灭菌规程。无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无 菌操作，防止微生物污染

2、。单向流空气区与工作台面，必须进行洁净度验 证。微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。微生物实验室的质量管理为满足微生物学实验要求，微生物实验室应具有：严格分开的无菌检查、微生物限度检查、无菌采样室。菌种处理与微生物鉴别室有局部百级措施。各自分开的抗生素微生物检定、细菌内毒素检查、抗菌作用测定半无菌 室。培养室（一般为100，000级）。试液及培养基的配制室。灭菌室。实验器皿洗涤、烘干室。人员办公休闲室。实验用品、易耗品储藏室。微生物实验室的质量管理设施和设备的管理特殊标准品菌种培养基、缓冲液、试剂消毒剂文件管理培训内审微生物实验室的质量管理微生物室实验室的质量管理制定洁净室（

3、无菌室）的使用管理规程（SOP）菌种处理相关的标准操作规程（SOP）生物安全柜的使用标准操作规程（SOP）带菌废弃物的处理标准操作规程（SOP）环境消毒标准操作规程（SOP）环境清洁、消毒标准操作规程（SOP）试液及培养基配制的标准操作规程（SOP）实验器皿洗涤标准操作规程（SOP）建立无菌室使用登记册使用日期，时间，使用人，设备运转状况，温、湿度，洁净度状况 （沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数），报修原因，报修结果，清洁 工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手），消毒液名称 等微生物实验室的质量管理实验室使用管理1. 每天工作前用消毒液消毒工作台，开紫外灯（最少半小时）进行空气消 毒，

4、每月定期做彻底清洁工作，适当时用消毒剂进行熏蒸。2. 非必要品禁止带入实验室，必要资料和记录应消毒后进入并应远离操作 台。3. 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。4. 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。5. 在每次实验结束时，应用消毒剂及时按消毒规程中的要求消毒操作台和 洁净室（区），并开启室内紫外灯以杀灭存留微生物。6. 使用后的器具如平皿、试

5、管，所有微生物培养物，染菌/带菌物品等应 用消毒液浸泡（至少24小时以上），经煮沸或灭菌后清洗或丢弃。微生物实验室的质量管理l洁净室（无菌室）的使用管理每季度定期进行清洁度再验证，以确保洁净度符合规定，保存原始记录 及趋势分析资料，定期归档保存。至少每年一次定期更换新的紫外灯管并记录，以确保紫外灯管灭菌持续 有效，定期归档保存。至少2年1次，或按洁净度验证实际情况，定期更换初效、中效、高效 头。以确保净化系统的功能持续有效，并同时在使用登记本上做好更换 记录。定期归档保存。平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭 或安装自动闭门器使其保持关闭状态。发现洁净度不符合规定时，

6、应立即停止使用，寻找原因，彻底清洁、消 毒，须经清洁度再验证符合规定后，才再使用，并将情况记录在无菌室 使用登记册上，定期归档保存。非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人 员或维修人员应进行指导和监督。微生物实验室的质量管理一、实验室设施与设备和管理设施洁净室、净化工作台、生物安全柜。设备高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。实验仪器全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心 机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂 家、购买日期。质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调

7、试记录、计量 检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP） 、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录 。微生物实验室的质量管理一、实验室设施与设备和管理1. 定期监测生物安全柜和（或）超净工作台的内表面的微生物学质量及其 内部的空气质量（粒子和微生物）。使用时检查压差指示表。2. 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。3. 定期用中性的清洁剂或消毒剂清洗培养箱（或室）、冷藏箱（或室）、 冷冻冰箱及水浴的腔室内表面。4. 高

8、压灭菌柜、电热恒温干燥箱等需要验证和持续监控。5. 仪器的校准和确认。微生物实验室的质量管理 需要确认和验证试验和 持续的质量监控的设备高压灭菌柜和电热恒温干燥去热原烘箱安装确认（IQ）：要确认控制系统及其他仪器仪表的设计是否得当并经 过校验。检查有关共用介质（如蒸气、水和空气等）符合灭菌工艺的要 求。运行确认（OQ）：要求证明空载状态下验证方案中所述腔室内所有关 键位置的温度是否均处在规定范围内。建立热分布图谱。空载状态下， 湿热灭菌当腔室工作温度不低于121时，各点温度与腔室内平均温度 之差不超过1 ，于热除热源，当运行温度不低于250 时，腔室内 的温差应不得超过15 。性能确认（PQ）

9、：要求在满载条件，温度探头插入待灭菌物品的内部， 同时加入一定浓度的微生物或独立的生物指示剂。对不同的工艺条件（物品、包装和装载方式、灭菌参数等），分别进行 性能确认试验，包括热穿透试验和生物指示剂挑战试验。包括：高压灭菌柜、除热源电 热恒温干燥箱、自动微生物鉴 别系统和计数系统。微生物实验室的质量管理品种：520倍稀释的碘伏水溶液0.10%新洁尔灭容易1:50的84消毒液75%乙醇溶液3%碘酒溶液5%石碳酸（来苏儿）消毒溶液2%戊二醛水溶液尼泊金酒精消毒液等应定期更换消毒剂品种，按标准准确配制。l清洁、消毒剂的管理微生物实验室的质量管理一、菌种的保存与管理1. 菌种特殊的标准品应保持基生长特

10、性和减少污染，是微生物实验结果一致性的重要保证。2. 制定菌种保藏管理制度微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性；防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。菌种名称：金黄色葡萄球菌菌种系列号：CMCC(B)26003传代次数：第 4 代 有 效 期： 年 月 日 制备日期： 年 月 日 传 代 人：王熙凤微生物实验室的质量管理菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心或A

11、TCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接收、确认记录。菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有菌种清单。验证实验常用菌种枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003生孢梭菌 CMCC（B）64941铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104大肠埃希菌 CMCC（B）44102乙型副伤寒沙门菌 CMCC（B）50094白色念珠菌 CMCC（B）98001黑曲霉 CMCC（B）9 003菌种保藏步骤 干燥菌种复苏，划平板 挑选特征典型的纯菌菌落；（制菌悬液使用） 确定保藏的合格菌体形态；

12、选择最适宜的保存方法，定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。菌种的接收 标准菌种一般是玻璃安平装的冻干粉剂 接收时应检查名称/数量和完整性。 贴好标签后储存于-20 一般安平冻干品可在5年之内使用 使用时应按（菌种保藏中心提供的）相关资料的要求进行复溶、培养和保存。菌种的复活 l 菌种的复活用70%的酒精擦拭清洁安瓿，自然风干 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿开 无菌操作，用一无菌吸管无菌移取12ml适宜的液体培养基到瓿中 ； 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解； 用无菌吸管将安瓶内菌液转移到相应的液体培

13、养基中， 根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24-72小时。 l 菌种的确认 菌种复活后，应确认菌种的纯度与特性从培养肉汤中取细菌培养物接种到平板上，上划线分离出单个菌落 。 培养后观察其是否具有典型的菌落形态 然后挑取单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及 菌形。 最后再做生化实验以进一步鉴定该菌种，或用API鉴定系统做鉴定 工作。 对已经过鉴定确认的菌种就可以进行菌种的传代和保藏了。菌种的传代和保藏l 菌种的保藏方法使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素

14、无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典） 将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为“一代”。冷冻真空干燥保藏法主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶型细致，不致损伤活菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。甘油冷冻管保藏法将待保藏菌接种至

15、平板或琼脂斜面，培养用无菌接种环轻轻刮取菌台，用接种环使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小试管。制好的甘油冷冻管最好在-30条件下贮存。有效期至少为2年。氧细菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厌氧菌则不适于用此法保藏。液体石蜡覆盖保藏法将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中培养，无菌操作在层流台下用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm，将试管直立，置于28冰箱中或室温下保存，如铜绿假单胞菌。此法保藏霉菌、放线菌、芽胞杆菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，一般无芽胞细菌也可保藏1年左右。此法制备简单，