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1、康腹止泻片微生物限度检查法康腹止泻片微生物限度检查法【摘要】 目的目的 建立康腹止泻片微生物限度检查法。方法方法 采用培养基稀释法。结果结果 该法能有效消除康腹止泻片在检验条件下对细菌、真菌及酵母菌的抑制作用;控制菌可用常规法检查。结论 该法简单、快捷，可用于康腹止泻片的微生物限度检查，有效控制其质量。 【关键词】 康腹止泻片;微生物限度检查;培养基稀释法康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用1，2，若用常规法对其进行微生
2、物限度检查，结果将不能真实反映样品的污染情况3。为此，根据中国药典2010 年版的有关规定4，对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证，以确定其是否适用于本品的微生物限度检查，从而准确有效地检出样品中污染的微生物5。验证表明，采用培养基稀释法对本品进行检查，可使污染的微生物能被顺利检出，常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行，能有效控制康腹止泻片的质量，并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。1 仪器与试药1.1 菌种金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、白色念珠菌CMCC(F)10123，
3、均购自中国药品生物制品检定所;黑曲霉(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。1.2 培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。1.3 供试品康腹止泻片(批号 41EA1)，大幸药品株式会社。2 方法与结果2.1 菌液的制备42.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，培养 1824 h;培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含菌数为 50100 cfu 的菌悬液。用于控制菌验证时制成每 1 mL 含菌数为100 cfu 的菌悬液。2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物
4、接种至改良马丁培养基中，培养 2448 h;培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含菌数为 50l00 cfu 的菌悬液。2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57 d，加入 0.9%无菌氯化钠溶液 35 mL，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内，用 0.05%(体积分数)聚山梨醇的 0.9%(体积分数)无菌氯化钠溶液制成每 l mL 含孢子数 50100 cfu 的孢子悬液。2.1.4 金黄葡萄球菌检测金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种
5、，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。3、血琼脂培养基：成分：营养琼脂 100ml脱纤维羊血（或兔血） 10ml制法：将营养琼脂加热融化，待冷至 50左右无菌操作加入脱纤维羊血（或兔血）摇匀，制成平板，置冰箱内备用。4、菌落特征：血琼脂平板：菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。Baird-Parker 平板：菌落呈圆形，光滑，凸起，湿润，直径为 23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围一混浊带，在其外层有一透明带。5、镜检：为革兰氏阳性菌，排列呈葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为 0.5um1um。2.2 供试液的制备取样品 10
6、 g，加入 pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液至 100 mL，用匀浆仪打碎，摇匀，制成 110 的供试液。2.3 验证试验验证实验所用培养基均按中国药典2010 年版附录“微生物限度检查法”要求，进行培养基适用性检查，且均符合规定。2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数(平皿法培养基稀释法) 在确定适合的检查方法后，验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。试验组:各取 110 供试液 1、0.5、0.2 mL 和试验菌液 1 mL，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组:取试验菌液 1 mL 注入平皿中
7、，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，测定所加的试验菌数。供试品对照组:各取 110 供试液 1、0.5、0.2 mL，按试验组操作，不加菌液，测定样品本底菌。计算各试验菌株的回收率，结果见表 1。表 1 计数验证菌各菌株回收率结果由表 1 可见:黑曲霉的回收试验，当供试液为 1 mL皿-1 时，3 次试验的回收率均即可达到 70%以上;白色念珠菌当稀释至 0.5 mL皿-1 时，3 次试验的回收率达到 70%以上;而大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 3 个菌株的回收率试验，要稀释至 0.2 mL皿-1，3 次验证的回收率才能均达到 70%以上。因此本品的细菌计数、
8、真菌及酵母菌计数均可用培养基稀释法检查:细菌计数用 0.2 mL皿-1，真菌及酵母菌计数用 0.5 mL皿-1。2.3.2 控制菌检查法的验证 本品为含有药材粉末投料的口服制剂,控制菌应检查大肠埃希菌和大肠菌群，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为试验菌。2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证 取 110 供试液 10 mL 及大肠埃希菌菌液 1 mL 加入 100、200 mL 的 BL 增菌培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行检验。2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证 取 110 供试液 1 mL 及大肠埃希菌菌液1 mL 加入不少于 15、30 mL 的胆盐乳糖发酵培养基中，按大肠菌群
9、的检查法进行检验。由表 2 可知，试验组均检出大肠埃希菌，因此本制剂的大肠埃希菌和大肠菌群均可用常规法检查。4 讨论本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分，有一定的抑菌作用，验证试验结果证明，本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等，或几法联用。由于本品是中成药，推断其抑菌作用不会太强，因此尝试采用培养基稀释法，通过扩大培养基的使用量，使供试品在培养基中稀释，结果各规定菌株的回收率均达到药典要求;控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单，不需要特殊仪器设备，只需增加培养基量，即可很好地消除本制剂在试验条件下的抑菌
10、作用问题，因此本方法简便快捷、准确有效，能很好地控制康腹止泻片的质量。表 2 控制菌验证结果作者：朱文娟，林铁豪，钟燕飞，林丽英 【参考文献】1 金晴昊，崔京浩，郭健鹏.老鹳草的研究J.时珍国医国药，2005，16(9)：840-841.2 金建玲，栾永娜，华国强.含小檗碱中药的抑菌活性与小檗碱含量的关系J.中医药学报，2005，33(5):19-21.3 许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性J.中国药品标准，2005,6(4):262,46-47.4 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部M.北京:中国医药科技出版社,2010:附录 79.5 林丽英,湛文青,饶春意.野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立J.中药材,2006,29(3):299-302.小组成员：制药小组成员：制药 101 班：陈妙珊、曾洁茹、郭慧芳班：陈妙珊、曾洁茹、郭慧芳
