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1、华中科技大学硕士学位论文人参皂甙Rb1对急性心肌梗死大鼠血管再生及心功能的影响姓名：刘咏芳申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管病）指导教师：刘正湘20080501独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论
2、文的规定即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2人参皂甙人参皂甙 Rb1 对急性心肌梗死大鼠血管再生及对急性心肌梗死大鼠血管再生及 心功能的影响心功能的影响 华中科
3、技大学同济医学院附属同济医院心血管内科 研究生： 刘咏芳 导 师： 刘正湘 中文摘要中文摘要 目的 研究人参皂甙 Rb1 对急性心肌梗死大鼠血管再生及心功能的影响,并对其作用机制作初步探讨。 方法 结扎 SD 大鼠左冠状动脉前降支,将大鼠随机分为人参皂甙 Rb1 治疗组、单纯手术组及假手术组。 1.手术 2 周，4 周后分别测定有关心功能指标。 2.TTC 和伊文思兰染色测定梗死区、缺血区的面积比值。 3.免疫组化方法检测心肌 VEGF 的表达量，VIII 因子和 SMA 染色观察微血管密度和功能血管再生情况。 4.Western blot 检测心肌 VEGF 蛋白的表达 结果 1.与假手术组
4、相比,单纯手术组大鼠LVPSP、dp/dtmax显著降低( *P 0.05) ,单纯手术组术后4周时光密度值明显低于手术后2周时( P 0.05)。Western blot所检测的VEGF蛋白的表达与上述结果相符。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 21表4 各组大鼠梗死边缘区心肌VEGF蛋白的表达水平（x s） Tab 4 The expression level of VEGF in all groups optical density afteroperated 2 weeks optical density after ope
5、rated 4 weeks sham-operated group n=100.1781+0.0321 0.1654+0.0249* operated group n=100.3238+0.0124 0.2034+0.0323* Ginsenoside Rb1treated group n=100.5534+0.0213 0.5415+0.0341*# 注：与假手术组比较*P0.01, *P0.05 ，与单纯手术组比较#P0.05 梗死边缘区VEGF蛋白的表达00.10.20.30.40.50.60.7sham operated groupoperated group Ginsenoside
6、Rb1 group光密度值术后2周 术后4周华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 22图1-A Western blot免疫印迹图 A：假手术组 B:单纯手术组 C人参皂甙Rb1组 图2-A 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2300.20.40.60.811.21.41.61.82假手术组单纯手术组人参皂甙Rb1组VEGF表达相对OD值图1-B 手术2周后， Western Blot 检测大鼠梗死边缘区心肌中VEGF蛋白的表达。 根据VEGF/-actin 密度分析，结果显示，
7、人参皂甙Rb1治疗组VEGF蛋白的表达明显高于心肌梗死组和假手术组（P0.01） ，心肌梗死组VEGF蛋白的表达亦高于假手术组（P0.05） 。 00.20.40.60.811.21.41.61.82假手术组单纯手术组人参皂甙Rb1组VEGF表达相对OD值图2-B 手术4周后， Western Blot 检测大鼠梗死边缘区心肌中VEGF蛋白的表达。 根据VEGF/-actin密度分析，结果显示，人参皂甙Rb1治疗组VEGF蛋白的表达明显高于心肌梗死组和假手术组（P0.01） ，心肌梗死组VEGF蛋白的表达亦与假手术组无显著性差异。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技
8、大 学 硕 士 学 位 论 文 24讨 论 讨 论 缺血性血管疾病已经成为威胁人类的主要疾病之一, 其治疗方法主要是药物、介入及外科手术治疗。 前者无法有效的阻止病程的进展;后两者对某些患者有明显的疗效,但对于病变严重而广泛者则疗效不佳。随着缺血性血管疾病的病理生理学、细胞分子学研究的日益深入,人们发现其治疗最终要靠血管再生( revascularization)。病理学及组织学研究发现,治疗性血管再生中包含了3种血管生成模式,即血管新生(angiogenesis)、血管发生(vasculogenesis)及动脉生成( arterogenesis) ,各种模式又分别涉及了不同的分子及细胞机制8
9、-10。在3种血管生成模式中,血管新生是目前国内外研究最集中的一种模式。 血管新生主要是指在组织损伤、伤口愈合等病理情况下,通过血管内皮细胞的分化、增殖迁移,由已经存在的血管通过出芽的方式生成新的毛细血管,进而彼此吻合形成毛细血管网。 而出生后的血管再生方式主要包括血管生成(angiogenesis) 和动脉生成(arteriogenesis) 。血管生成是指缺血区由于缺血、缺氧引起的已经存在的血管通过细胞增殖、出芽形成新的血管网的过程 。新生成的血管网可改善组织细胞的氧和营养物质的供给。动脉生成是指由于动脉阻塞,血流再分配使侧支微动脉(arteriole) 血流量增加、 血管内剪切力增加,引
10、起细胞增殖、血管重塑从而形成大的有功能的侧支传导动脉的过程。所形成的动脉能够有效地恢复动脉阻塞所致缺血区的血液供应。 尽管在缺血性心脏病患者中存在自发形成侧枝循环的趋势,然而,其速度与程度均不足以代偿机体的需要。 而血管再生性治疗可促进血管形成和开放冠脉侧枝循环,为缺血心肌提供新的血液供应,挽救顿抑心肌,减少心肌细胞、血管内皮细胞等的死亡数量。冠脉侧枝循环的建立包括原有侧枝的开放和新侧枝的形成。微血管密度是直接反映侧枝血管形成最可靠的指标,梗死范围也间接反映侧枝循环情况,梗死面积越小,说明侧枝循环越丰富。 采用这可靠的两个解剖学指标,基本上能反映缺血心肌冠脉侧枝血管新生情况,在一定程度上能反映
11、冠脉侧枝循环血供情况。 本研究通过免疫组织化学方法检测内皮细胞因子表达,据此计算梗死灶及边缘区的微血管密度,结果表明,人参皂甙Rb1治疗1周,治疗组大鼠心肌组织中微血管密度明显高于缺血再灌注组及假手术对照组。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 25血管再生过程中涉及到许多细胞因子，包括血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子(FGF)、基质金属蛋白酶（MMPs）、血小板源性生长因子（PDGF）、血管生成素（ANG）、肿瘤坏死因子-（TNF-）、胎盘生长因子（PIGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）、胰岛素样
12、生长因子（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素-8（IL-8）等。VEGF是目前动物和临床实验研究得最为深入的促血管生长因子，VEGF在缺血组织和肿瘤中特异程度最高。VEGF在血管的再生过程中起着非常重要的作用，它直接特异的作用于血管内皮干细胞，内皮细胞等，引起内皮细胞增殖11。 VEGF是治疗心肌缺血十分有潜力的因子之一， VEGF是一种有丝分裂原,能结合、激活两个主要的内皮特异性受体:酪氨酸激酶KDR和Flt-1。KDR 和Flt-1 可以激活内皮细胞的许多信号传导通路,以此来激活内皮细胞的增生、 迁移和一氧化氮合酶的释放,调节细胞增生、迁移、分化和凋亡,影响机体的心血管系统,促
13、进内皮细胞增殖及侧支循环的生成及受伤后组织的修复12-19 。最初的研究是利用VEGF 刺激内皮增长,加速内皮再生,后来的临床研究利用VEGF 促血管生成的作用,可以引起侧支循环形成,实现内源性心肌再血管化,增加缺血的心肌灌注,增加冠脉血流量,缓解心绞痛,减少梗死面积。实验证明它们在体内及体外均有很强的促进血管再生的活性。研究结果显示,在缺血的心肌或者血管内直接注射VEGF的质粒,编码VEGF基因的腺病毒载体或VEGF 蛋白,确实具有诱导侧支血管的形成、增加缺血部位血流灌注的作用20-22。VEGF的血管再生作用较早引起人们注意的是在恶性肿瘤研究中, 人们发现肿瘤中大量新生的血管与肿瘤组织中V
14、EGF过度表达密切相关, 因此,于裸鼠恶性肿瘤内注入VEGF单克隆抗体, 瘤体显著缩小。 VEGF是一种分泌型可溶性蛋白,能直接与血管内皮细胞上VEGF受体结合,使受体磷酸化,激活蛋白激酶,诱导血管内皮细胞增殖,从而促进血管再生,增加血管通透性。此外, VEGF还可以增加血管内皮细胞尿激酶类纤维蛋白原活化因子受体的表达和血管的通透性,促进细胞浸润与血管生成时临时基质的形成,这也被认为是其促进血管新生的机制之一。而且VEGF 是强烈的有丝分裂原,可以相对特异性地作用于内皮细胞,对血管壁的成纤维细胞和平滑肌细胞没有影响,因此可以避免在发挥促血管生成作用时引起血管内膜异常增生等副作用。 华 中 科
15、技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 26中医药在治疗缺血性疾病的临床中获得了良好的疗效。其作用机制相当复杂，但促进血管再生可能是其作用重要机制之一。在本试验中大鼠心肌梗死后,免疫组化和Western blot检测均显示术后2周各组心肌VEGF蛋白水平较手术前均有明显增加,而术后4周时假手术组及对照组VEGF蛋白水平较术后2周有所下降,说明创伤、炎症和缺氧等因素所引起的自身心肌VEGF的表达上调在术后2周后开始逐渐减弱。而人参皂甙Rb1治疗组大鼠心肌VEGF蛋白表达水平均明显高于同一时间点对照组及假手术组,说明手术2周以后,人参皂甙 Rb1使心肌VE
16、GF蛋白表达仍然维持较高水平。侧支循环的形成需在梗死后经过一个较长时期,并且需要细胞因子长期反复刺激才能实现。 虽然创伤、炎症和缺氧等因素可以引起对照组和假手术组的代偿性VEGF蛋白水平升高,但这种效应在梗死后2周左右即开始消退,因此无法真正建立有效侧支循环。在人参皂甙Rb1治疗组,由于在自身代偿性分泌VEGF的消退期仍然持续应用人参皂甙Rb1药物刺激心肌表达VEGF,使心肌梗死周边区毛细血管密度显著增加。而且对大鼠血流动力学的检测也证实了血运重建的有效性。我们的实验证实了人参皂甙Rb1可以促进急性心肌梗死大鼠缺血心肌微血管和功能血管的再生,促进具有明显促血管生长活性的VEGF在缺血心肌局部的表达，增加缺
