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1、宁波大学硕士学位论文二十二碳六烯酸联合5-氟尿嘧啶对胃癌细胞生长的影响姓名：卓志红申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：张乐鸣20090410宁波大学硕士学位论文二十二碳六烯酸联合 5-氟尿嘧啶对胃癌细胞生长的影响摘要目的 化疗药物的毒副作用大和易引起耐药等棘手问题是胃癌复发和治疗失败的最主要原因之一，因此解决耐药问题和优化化疗方案显得尤为必要。二十二碳六烯酸能选择性杀伤肿瘤细胞，具有抑制癌细胞增殖、纠正细胞周期功能紊乱、诱导凋亡等作用，但对其确切的抑癌机制目前还不十分清楚。本研究拟评估 DHA 联合 5-氟尿嘧啶对胃癌 SGC7901 细胞生长抑制作用；用敏感度和特异性高的 Annexin
2、-V/PI 证实 DHA 联合5-FU 对诱导胃癌细胞凋亡更明显；并对凋亡相关基因表达半定量分析，初步探讨 DHA与 5-FU 联合可增强抑瘤、凋亡效应的作用机制。方法 1.台盼蓝拒染检测 DHA、5-FU 两药单用和联用对细胞活力的影响，联合系数判断两药合用效果；2.光学、倒置显微镜下观察两药作用 SGC7901 细胞后生长状况；3.PI 染色流式细胞术检测亚二倍体峰比并拟合细胞周期曲线；4.Annexin-V/PI 双标记检测早期凋亡；5.RT-PCR 方法检测 fas、bcl-2、bcl2l12、bim、bax、caspase-9 和caspase-3 基因表达。结果 DHA 可抑制 S
3、GC7901 细胞生长，且呈剂量和时间依赖性（P10000个，最好20000-30000个），实验取细胞处于对数生长期，一般在6080比较好。（2）标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰，同时实验前进行细胞的同步化处理，减少差异。4. Annexin-V/PI双标记测定细胞凋亡（早期凋亡）当细胞发生早期凋亡时改变发生在细胞膜表面，PS（磷酯酰丝氨酸）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜表面，PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin-V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷
4、脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。Annexin-V作为凋亡的指标并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。由于坏死细胞PS亦暴露于外表使Annexin-V结合阳性，因此必须同时采用PI这一坏死细胞染色阳性的DNA染料将坏死细胞区分出来。使用FITC标记Annexin-V，同时结合使用PI拒染法。个人体会：与PI法检测凋亡不同的是该法不需要固定细胞，因此凋亡细胞PI低染。Annexin-V/PI双参数法可将正常细胞、凋亡细胞、死亡细胞区分开来，其凋亡检出率更有特异性。该法既可检测早期凋亡，又可将凋亡及死亡细胞区分开- 36
5、-宁波大学硕士学位论文来，较PI、TUNEL具有更高的灵敏性及特异性。检测早期凋亡优于TUNEL法及PI法，且不需固定，省时省力。5.RT-PCR检测基因mRNA表达逆转录 PCR 是聚合酶链式反应的一种。由一条 RNA 单链转录为互补 DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。 随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖 DNA 的 DNA 聚合酶完成，随 每个循环倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶 H 降解，留下互补 DNA。 主要分：（1）预变性：破坏 DNA 中可能存在的较难破坏的二级结构。DNA 充 分变性，
6、减少 DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合， 使 PCR 反应得以顺利进行。 （2）变性-退火-延伸循环：双链 DNA 解离成单链，模板 DNA 结合 与引物互补序列配对结合；以靶序列为模板，DNA 模板-引物结合物按碱基配 对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。 （3）72 度 10 分钟：使 PCR 反应完全以提高扩增产量。参考书目：1J.莎姆布鲁克（著）, 黄培堂（译）. 分子克隆实验指南（上下 册）. 第三版. 北京: 科学出版社, 2002.23 2005.4司徒镇强, 吴军正. 细胞培养. 北京: 世界图书出版公司, 1996.王
7、建中. 临床流式细胞分析. 上海: 上海科技出版发行有限公司,左连富. 流式细胞术与生物医学. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1996.- 37 -宁波大学硕士学位论文在学研究成果一、 在学期间取得的科研成果1. 宁波市医学科技计划项目（2008003）立项；名称：二十二碳六烯酸与 5-氟尿嘧啶对胃癌联合抑制效应的研究；人员：张乐鸣，卓志红，牧启田，楼燕如，张怡。2. 宁波市医学科技计划项目（200520）结题；人员：牧启田，卓志红等。二、 在学期间所获的奖励2007 年绣山奖学金，2008 年杏琴园研究生奖助学金，2008 年校三好学生。三、 在学期间发表的论文1Zhihong Zhuo,
8、Leming Zhang, Qitian Mu, Yanru Lou, Zhaohui Gong, Yijiu Shi,Guifang Ouyang, Yi Zhang. The effect of combination treatment with docosahexaenoic acid and 5-fluorouracil on the mRNA expression of apoptosis-related genes, including the novel gene BCL2L12, in gastric cancer cells. In Vitro Cellular & Dev
9、elopmental Biology Animal, 2009, 45(1-2): 69-74. (SCI)2卓志红, 张乐鸣, 牧启田, 等. 二十二碳六烯酸联合 5-氟尿嘧啶对胃癌细胞生长及 bcl-2、bcl2l12 和 bax 表达的影响. 中华普通外科杂志, 2009, 24(1): 66-70.3163-165.4卓志红, 龚朝晖. DNA 甲基化与乳腺癌. 癌变畸变突变, 2008, 20(2) :卓志红, 张乐鸣. 二十二碳六烯酸与恶性肿瘤. 宁波大学学报(理工版) ,2009, 22(1) : 129-133.5卓志红, 牧启田, 张乐鸣, 等. 硼替佐米上调 fas,bcl
10、2l12,caspase-3 和caspase-9 基因表达诱导 K562 细胞凋亡. 中国病理生理杂志, 2009 年组版待发表.6黄新建, 牧启田, 卓志红, 等. 蛋白酶体抑制剂 PSI-341 对白血病细胞株SHI-1 的生长抑制作用. 浙江医学, 2008, 30(7) : 694-695, 700.78卓志红, 张乐鸣. 快速康复外科与结肠癌手术. 现代实用医学, 2009 年待发表.卓志红, 张乐鸣. 基质金属蛋白酶-2 和基质金属蛋白酶抑制剂-2 与乳腺癌.现代实用医学, 2009 年待发表.- 38 -宁波大学硕士学位论文致谢首先感谢我的导师张乐鸣教授对我的辛勤培养和关怀。本
11、实验是在导师悉心指导下完成，凝聚着他的心血。导师对科学孜孜不倦地追求的态度，对学术的严谨作风将是我终生学习的榜样。在这三年来导师对我实验的指导，论文开题、撰写、修改以及论文的答辩的安排等等事情，充分体现了对我无微不至的关心！感谢宁波市干细胞移植重点实验室研究项目 2006A62003，宁波市医学科技计划项目 2008003、200520，宁波市重点学科带头人项目资金支持！感谢宁波市第一医院重点血液实验室牧启田、楼燕如等老师对我的实验技术指导和帮助！感谢宁波市第一医院普外科、肿瘤科、妇产科、科教科等科室的全体老师对我临床实践的指导和关心！感谢宁波大学医学院龚朝晖、郭俊明、王国良、罗琳等各位老师对我的指导和帮助！感谢我的师兄、师弟、师妹们的帮助和关心！感谢所有帮助我的全体老师、同学及朋友们！感谢我的家人三年来对我学业的物质支持和精神鼓励，是我完成学业的保证！- 39 -
