《人骨髓间质干细胞诱导突变致瘤的分子机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人骨髓间质干细胞诱导突变致瘤的分子机制研究（129页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、博士学位论文人骨髓问质干细胞诱导突变致瘤的分子机制研究人骨髓间质干细胞诱导突变致瘤的分子机制研究中文摘要在体外用G M C S F 和I L 一4 刺激人胚胎骨髓间质干细胞( M S C s ) 向树突状细胞( D C s ) 分化的过程中，我们发现了一种新的细胞，经克隆化培养和鉴定，具有肿瘤特性，命名为F 6 细胞株。本文旨在研究F 6 肿瘤细胞的发生机制。我们应用下列方法( 1 ) 采用荧光差异显示( F D D ) 技术寻找M S C s 诱导致瘤( F 6 )的关键基因。( 2 ) 采用实时定量P C R ( R T P c R ) 技术、W e s t e r nb l o t t
2、i n g 、P I 染色流式细胞仪鉴定F 6 细胞和间质干细胞中相关基因的表达。( 3 ) 采用R T P C R ，W e s t e r nb l o t t i n g ，免疫组化，荧光显微镜，共聚焦显微镜，研究n u c l e o s t e m i n基因在F 6 细胞和c o s 7 细胞的特性。( 4 ) 利用R N A i 、W e s t e r nb l o t t i n g 、流式细胞仪技术，探讨n u c l e o s t e m i n 对F 6 和U 9 3 7 细胞增殖的影响。( 5 ) 利用R e a l t i m eR T P C R 定量检测F 6
3、 致裸鼠肿瘤瘤组织及人肺癌患者肿瘤组织的n u l e o s t e m i n 、c y c l i nI 和s i v a 基因的表达特性。研究取得以下结果：( 1 ) 荧光差异显示成功地分离了胚胎M S C s 和F 6 肿瘤细胞之间的不同基因片段，T A 克隆得到1 5 个E S T 片段，G e n e B a n k 序列比对分析表明，这些片断均与相关基因片断同源，其中C 3 5 6 ，G 3 9 2 和G 3 8 3 分别与n u c l e o s t e m i n ，c y c l i nI 和S i v a 基因同源( 9 5 ，9 7 ，1 0 0 ) 。( 2 )
4、从L T E P a _ 2 细胞中克隆了n u c l e o s t e m i n 的全长基因( 1 6 5 0 b p ，G e n B a n k接受序号：A Y 8 2 5 2 6 5 ) ，并且在大肠杆菌中表达G S T n u c l e o s t e m i n 蛋白。观察了它在F 6 和其它4 种人肿瘤细胞株( L T E P _ a 一2 ，U 9 3 7 ，S W 4 8 0a n d9 5 D ) 中的表达特性。同时，用p c D N A 3 1 ( + ) 一G F P - n u c l e o s t e m i n 转染C O S 7 细胞，在4 2 0 周
5、内，其细胞体积和核都增大，细胞呈巨细胞样改变，提示细胞分裂时n u c l e o s t e m i n影响细胞微管和微丝系统。W e s t e r nb l o t t i n g 表明n u c l e o s t e m i n 在F 6 ，L T E P - a - 2 ，U 9 3 7 ，S W 4 8 0a n d9 5 D 的细胞核和细胞浆中的表达水平比在M S C s 和C O S - 7 中明显增高( p 刮垡2 3 1 到! 剑巡Q ! ：纠皿H o m os a p i e n sg u a n i n en u c l e o t i d eb i n d i n
6、gp r o t e i n 一1 i k e3 ( n u c e o l a r )( G N L 3 ) ，t r a n s c r i p tv a r i a n t1 ，m R N AL e n g t h = 2 0 4 8S c o r e = 6 0 3b i t s ( 3 0 4 ) ，E x p e c t = e 一1 6 9I d e n t i t i e s = 3 3 8 3 5 5 ( 9 5 )S t r a n d = P l u s P l u sQ u e r y ：1g g c a t g t t t g c t g c a g a a g a
7、g a c a g g g g a g g c a c t g t c t g a g g a g a c t a c a g c a g g t g a a6 0 | | IS b j c t ：1 6 8 6g g c a t g t t t g c t g c a g a a g a g a c a g g g g a g g c a c t g t c t g a g g a g a c t a c a g c a g g t g a a1 7 4 5Q U e r y ：6 1c a g t c t a c a a g g t c t t t t a t c t t g g a t
8、a a a a t c a t t g a a g a g g a t g a t g c t t a t g a c t t c1 2 0 S b j c t ：1 7 4 6c a g t c t a c a a g g t c t t t t a t c t t g g a t a a a a t c a t t g a a g a g g a t g a t g e t t a t g a c t t c1 8 0 5Q u e r y ：1 2 1a g t a c a g a t t a t g t g t a a c a g a a c a a t g g c t t t t t
9、 a t g a n n n n n n n n n n a a c a t t t t a a g1 8 0 | l | | l I_ l l |S b j c t ：1 8 0 6a g t a c a g a t t a t g t g t a a c a g a a c a a t g g c t t t t t a t g a t t t t t t t t t t a a c a t t t t a a g1 8 6 56 l博士学位论文人骨囊同质干细胞诱导突变致癌的分子机制研究1 8 1c a g a c t g c t a a a c t g t t c t c t g t a
10、 t a a g t t a t g g t a t g c a t g a g c t g t g t a a a t t t t g t g2 4 0 f f | | 1 8 6 6c a g a c t g c t a a a c t g t t c t c t g t a t a a g t t a t g g t a t g c a t g a g c t g t g t a a a t t t t g t g1 9 2 52 4 1a a t a t g t a t t a t a t t a a a a c c a g g e a a c t t g g a a t c c c
11、t a a a t t c t g t a a a a a g a c a a t t3 0 0 | 1 I1 9 2 6a a t a t g t a t t a t a t t a a a a c c a g g c a a c t t g g a a t c c c t a a a t t c t g t a a a a a g a c a a t t1 9 8 53 0 1e a t e t c a t t g t g a g t g g a a g t a g t t a t e t g g a a t n n n n n n n g a a g a t a c c t a t t
12、g3 5 5 f | f 1 9 8 6e a t n t c a t t g t g a g t g g a a g t a g t t a t e t g g a a t a a a a a a a g a a g a t a c c t a t t g2 0 4 02 人类n u c l e o s t e m i ne D N A 全长克隆L T E P 一矿2 细胞中N u c l e o s t e m i nc D N A 通过R T - P C R 进行扩增，它包含1 6 5 0 b p 的开放式阅读框架( 图2 A ) 并插入p M D 一1 8 T 质粒中( 图2 B ，l
13、 a n e1 ) 。4 3k b 的条带是用肌门删( 图2 B ，l a n e2 ) ，舰，( 图2 B ，l a n e3 ) ，4 筇( 图2 C ，l a n e1 ) ，X h o I ( 图2 C ，l a n e2 ) 酶切，l _ 6 5 k b 的目的条带是用B a l i 和X h o I ( 图2 B ，l a n e4 ) 酶切，1 i k b 的片段是用K p n I ( 图2 C ，l a n e 3 ) 酶切。对插入n u c l e o s t e m i nc D N A 全长的克隆载体进行测序( 图9 ，1 0 ) ，并将测序结果提交G e n e B a
14、 n k ( 鱼g 垦基接受度墨教；丛8 垒塑墨) 。! 墼垫 R e p o r t sH o m os a p i e n sc e l1 g i ：5 6 1 2 2 8 2 3 L i n k sL O C U SA Y 8 2 5 2 6 51 6 5 0b pm R N A1i n e a rP R l0 5 - D E C 一2 0 0 4D E F I N I T I O NH o m os a p i e n se e l l - 1 i n eL T E P a 一2h U e l e o s t e m i n ( N S ) m R N A c o m p l e t
15、ec d s A C C E S S l 0 NA Y 8 2 5 2 6 5V E R S I O NA Y 8 2 5 2 6 5 1G I ：5 6 1 2 2 8 2 3K E y 霄O R D SS O L 】R C EH o m os a p i e n s ( h u m a n )O R G A N I S MH o m os a p i e n sE u k a r y o t a ：M e t a z o a ：C h o r d a t a ：C r a n i a t a ：V e r t e b r a t a ：E u t e l e o s t o m i ：M
16、a m m a l i a ：E u t h e r i a ：E u a r c h o n t o g l i r e s ：P r i m a t e s ：C a t a r r h i n i ：H o m i n i d a e ：H o m o R E F E R E N C E1 ( b a s e slt o1 6 5 0 )A U T H O R ST s a i ，R a n dM c K a y ，R T I T L ET s a i R y a n dM c K a yP , D ：An u c l e o l a rm e c h a n i s mc o n t r o l l i n gc e l lp r o l i f e r
