《脐血单个核细胞体外扩增后植入NODSCID小鼠重建多系造血的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脐血单个核细胞体外扩增后植入NODSCID小鼠重建多系造血的研究（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、脐血单个拔细胞体外扩增后植入N O D S C I D 小鼠重建多系造血的研究缩写A N o v AA n n e x i nVA P CB F U EB MC BC F CC F UC F U - G E 删C F U G M缩略词表英文中文a n a l y s iso fv a r i a n c e方差分析膜联蛋白Va l l o p h y c o c y a n i n别藻蓝蛋白b u r s t f o r m i n gu n i t e r y t h r o i d红系爆式集落形成单位b o n em a r r o w骨髓c o r db l o o d脐血c o l o
2、 n y f o r m i n gc e l l集落形成细胞c o l o n y f o r m i n gu n i t集落生成单位c o l o n y f o r m i n gu n i t 。g r a n u l o c y t e e r y t h r o c y t e m a c r o p h a g e m e g a k a r y o c y t e 粒、红、巨噬、巨核细胞集落生成单位c o l o n y f o r m i n gu n i t + g r a n u l o c y t e - -m a c r o p h a g e粒细胞巨噬细胞集落生成
3、单位C h i s q u a r et e s t卡方检验F B Sf e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清F C Mf l o wc y t o m e t r y流式细胞仪F i c o l l - - H y p a q u e聚蔗糖一泛影葡胺F I T Cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e异硫氰酸荧光素F LF l t 3l i g a n dF l t 3 配体G - C S Fg r a n u l o c y t ec o l o n y s t i m u l a t i n gf a c
4、 t o r粒细胞集落刺激因子G M - C S Fg r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n y咖H E SH P P C F CH S C TH S P Cs t i m u l a t i n gf a c t o r粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子g r a f t v e r s u s h o s td is e a s e移植物抗宿主疾病h y d r o x y e t h y ls t a r c h羟乙基淀粉h i g hp r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a lc o l o
5、n y f o r m i n gc e l l s高增殖潜能集落形成细胞h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n造血干细胞移植h e m a t o p o i e t i cs t e m p r o g e n i t o rc e l l造血干祖细胞脐血单个核细胞体外扩增后植入N O D S C I D 小鼠重建多系造血的研究I L - 3i n t e r l e u k i n 一3I L - 6i n t e r l e u k i n 一6I 蛐瑚i s c o v e sm o d
6、 i f i e dd u l b e c c o sm e d i u mI n d e p e n t e n tS a m p l e sT - t e s tL T C - I C贼CN o D s c mP B Sp B F ir EP C RP EP SS C FS P FS R CT P O白细胞介索一3白细胞介素一6i s c o v e 改良m o d i f i e dd u l b e c c ol o n g t e r mc u l t u r e i n i t i a t i n gc e l lm o n o n u c l e a rc e l ln o n
7、o b e s ed i a b e t i c s e r i o u sc o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c yd i s e a s ep h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o np r i m i t i v eB F U - e r y t h r o i dp r o g e n i t o rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np h y c o e r y t h r i np h o s p h a t i d y ls e
8、r i n es t e mc e l if a c t o rs p e c i f i e d p a t h o g e n sf r e eS C I Dm o u s e r e p o p u l a t i n gc e l lt h r o m b o p o i e t i n独立样本T 检验长期培养起始细胞单个核细胞非肥胖糖尿病严重的联合型免疫缺陷病磷酸盐缓冲溶液早红系爆式集落生成单位聚合酶链式反应藻红蛋白磷脂酰丝氨酸干细胞因子无特定病原体的联合型免疫缺陷鼠重建细胞血小板生成素，2 脐血单个核细胞体外扩增后植入N O D S C I D 小鼠重建多系造血的研究脐血单个核细胞
9、体外扩增后植入N O D S ClD小鼠重建多系造血的研究硕士研究生：彭盘俐导师：毛平教授单位：广州医学院附属广、i t 市第一人民医院血液内科中文摘要脐血以其采集方便、干细胞含量丰富、G V H D 发生率低而成为造血重建的重要干细胞来源。但单份脐血所含的造血细胞数往往仅能用于儿童和低体重成人患者，脐血的体外扩增有望克服这一障碍，但扩增后脐血造血细胞的植入能力是否受到影响，造血重建能力能否得以维持是国内外学者和临床医生关注的热点。本实验室以往的研究证实了以脐血单个核细胞( 州C ) 为起始培养细胞不仅减少细胞损失简化实验操作，而且能够实现有效的扩增，为此我们继续探讨脐血M N C 扩增后移植
10、动物的情况，尝试寻找一套扩增后脐血应用于临床移植的完整可行方案。目的探讨脐血M N C 在体外扩增后植入能力的改变以及对N O D S C I D 小鼠造血重建的影响，寻找扩增后脐血应用于临床移植的可行方法。材料与方法：1 脐血来源：采自足月正常分娩的健康产妇后A c D _ A 抗凝，共采集l O 例，均来源广州医学院附属广州市第一人民医院妇产科和广东省人民医院妇产科。2 动物与饲养：6 8 周龄N O D S C I D 小鼠3 6 只，购自中山大学实验动物中心，饲养于该中心无特定病原体( S P F ) 环境。3 脐血M N C 的分离与液体悬浮培养：脐血采集6 小时内用H E S 联合
11、F i c o l l H y p a q u e 密度梯度离心法提取M N C ，按l 1 0 5 m l 接种于含无血清培养基的5 0 m l 培养瓶中，在5 C 0 z ，3 7 “ C 及饱和湿度条件下连续培养1 4 天。按细胞因子组合的不同分组如下：A 组：空白对照，不加任何细胞因子；B 组：加入S C F 、F L 和I L 一6 ；C 组：加入S C F 、F L 、I L 一6 和I L 一3 。分别在培养的0 天，6 天，l O 天，1 4 天取出少量细胞用于计数细胞总数，c D “+ 、c D ：。+ “一细胞百分含量检测及C F U 、C F U G E M M 集落培养
12、。4 造血祖细胞集落培养：将细胞按2 1 0 5 m l 接种到含甲基纤维素半固体培养基的2 4 孔板中，置5 C 0 z ，3 7 C 及饱和湿度的培养箱中培养1 4 天，计数C F U ，培养脐血单个核细胞体外扩增后植入N O D S C I D 小鼠重建多系造血的研究至2 1 天时，计数C F U G E M M 。5 凋亡标记A n n e x i nV 的检测：严格按A n n e x i nV 试剂盒说明书操作处理0 5 1 0 5 个D 4 c ，流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。6 人脐血细胞移植N O D S C I D 小鼠：3 6 只N O D S C I D 小鼠给予2
13、5 0 c G y 的半致死剂量照射( 6 M Vx 射线加速器) ，照射率3 0 0 c G y m i n ，照射后4 小时内从尾静脉注入2 0 0 pl 生理盐水或M N C 悬液( 含5 1 0 6 细胞) 。实验分组：扩增组：1 8 只输注c 组扩增后脐血细胞；未扩增组：9 只输注等量新鲜脐血心c ；空白对照组：9 只输注2 0 0 ul生理盐水。移植后观察小鼠存活情况，6 周后处死存活小鼠，收集其外周血和四肢骨的骨髓细胞，脾、胸腺细胞。7 存活小鼠的人源性细胞表面标志分析：流式细胞仪检测存活小鼠四肢骨骨髓细胞的C D 4 5 - 、c 眦+ 、C D 。、C D 。+ 、c D 。
14、，+ 的含量，脾、胸腺细胞的C D t s 、C D “+ 、c D a + 、c D 。+的含量，抗体按产品说明书方法标记上机检测。8 人特异的C a r t - I 基因、A l u 基因检测：提取新鲜脐血细胞基因组D N A 为阳性对照，正常N O D S C I D 外周血基因组D N A 为阴性对照，8 一a c t i n e 作内参照。扩增C a r t - I 基因、A I u 基因和B a c t i n e 基因的反应体系和条件相同。扩增产物以2 0 9 L琼脂糖凝胶电泳分析结果。l O 统计学分析：实验数据以x s 表示，所有数据均采用S P S S l 0 0 软件分析
15、，统计方法为A N O V A 、c h i s q u a r et e s t 和I n d e p e n t e n tS a m p l e sT - t e s t ，P 0 0 5 ) 4 H u m a nh e m a t o p o e t i cce l li m p l a n t e de v i d e n c ei nN O D S C I Dm i c e ：4 1A n a l y s e so fh u m a ml eu c o c y t ea n t i g e nC D 4 5i nB Mc e l l s ，s p l e n o c y t e
16、sa n dt h y m o c y t e si ns u r v i v a lm i c e ：T h eh u m a ml e u c o c y t ea n t i g e nC D 4 5c o u l db ed e t e c t e di nB Mc e l l s s pl e n o c y t e sa n dt h y m o c y t e so fs u r v i v a l m i c ea f t e rt r a n s p l a n t a t i o n I nB Mh u m a nC D d 5 + c e l lo fa m p l i f i c a t i o ng r o u pw a s ( O 4 2 2 1 3 ) a n dt h a t o fn o n am p l i f i c a t i o ng r o u pw a
