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1、E S T P a R R 孓P 衄E D NC S l FE G F RN E S HP D G F RA P CR P l l C1 G Fe r b B 2M A P K 卧1E x p r e s s e ds e q u e n c et a g表达序列标签P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n多聚酶链反应R e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n 反转录多聚酶链反应r e a c t i o nW o d eh e a l t ho r g a
2、n i z a t i o n世界卫生组织c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e4周期素依赖激酶4m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e2基质金属蛋白酶2t o p o i s o m e r a s e ( D N A ) l拓扑D N A 异构酶1 E W Sg e n e尤因肉瘤基因C o m l a n i v ec h r o m o s o m eh y b r i d z a t i o n比较染色体组杂交T r a n s d u c e rlo f e r b B - 2e r b
3、 B 2 转导蛋白IT u m o rn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r 表皮生长因子受体通路底物8p a t h w a ys u b s t r a t e8E o s i n o p h i l - d e r i v e dn e u r o t o x i n 嗜酸细胞来源的神经毒素C l e a v a g es t i m u l a t i o nf a c t o r 剪切束4 激因子E p k i e n n a lg r o w t h
4、f a c t o rl e p A j p t l ) r表皮生长因子受体 N e wm o l e c u l ec o n t a i n i n gS H 3d o m a i aN E S H 蛋白P l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r血小板源性生长因子受体A n a p h a s e - P r o m o t i n gC o m p l e x有丝分裂后期促进复合体R e c e p t o r p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e具有受体功能
5、的酪氨酸蛋白激酶T r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o r转化生长因子E r y f l u D b l a s t i cl e u k e m i av i r a lo n c o g e n e 成红细胞白血病病毒致癌基因同h o m o l 0 9 2源体2M i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e丝裂原激活的磷酸激酶I n t c r l e u k i n 1白细胞介素l一一硎差言蚴硎眦嘲胶质瘤相关新基因表达研究胶质瘤相关新基因表达研究中文摘要第一部分：胶质瘤
6、相关基因的反向多点杂交研究目标利用反向多点杂交技术检测胶质瘤相关基因谱在胶质瘤组织中的表达情况，为这些基因在胶质瘤恶性进展中的作用提供依据，并找出具有进一步研究价值的基因。方法分别提取正常脑和胶质瘤标本中的总R N A ，并反转录为e D N A ，随机引物法标记探针，与点于特殊尼龙膜上的基因片断进行反向杂交。用复日S m a r t V i e w图像分析软件进行处理，将各个基因的表达强度和0 一a c t i n e 进行比对，根据比值作相关基因的半定量分析。结果与正常脑组织比较，2 级胶质瘤中表达上调的基因3 8 条，下调2 4 条；3级胶质瘤中有4 5 条基因上调，1 7 条基因下调：
7、4 级胶质瘤中有3 2 条上调，2 9条下调，1 条差异不明显。经方差分析，按病理级别分组，差异具有统计学意义( p 3 0 为( + + ) 。4 统计分析采用s p s s l l 0 软件包进行卡方检验、精确概率分析和k e n d a l l 相关分析。二结果E P S 8 蛋白主要位于肿瘤细胞胞膜和胞浆中，呈棕黄色颗粒状或弥散分布，细胞核基本未见染色。特别在肿瘤细胞连接处和细胞突起部位，E P S 8 蛋白染色更为明显，见彩图1 。大体所见E P S 8 蛋白在肿瘤细胞密集区域阳性率较高，部分标本的边缘肿瘤组织也可见到E P S 8 蛋白阳性肿瘤细胞密集区域。为更清晰、直观地说明E
8、P S 8 蛋白在胶质瘤中的表达情况，部分病例照片，见彩图3 5 。E P S 8 蛋白在胶质瘤中有不同程度的升高，其在W H O I I 级、级和级胶质瘤中阳性率均较正常脑组织明显升高( p O 0 5 ) ，但W H O l I 级、I I I 级和级胶质瘤之间阳性率无明显差异，详见表1 。K e n d a l l 相关分析显示胶质瘤中E P S 8 蛋白表达程度与E G F R 表达程度呈正相关，相关系数为O 6 9 8 ( p 0 0 5 ) ，详见表2 。但E P S 8 蛋白表达与P D G F R - n 表达之间无显著相关性，见表3 。方差分析显示随E P S 8 蛋白表达增
9、强，K 1 6 7 指数相应升高，并具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，见表4 。胶质瘤相关新基因表达研究1 W H O I I 、I I I 、I V 级胶质瘤与正常脑组织相比阳性率升高( p o 0 5 ) 。2 W H OI I 、I I I 、级胶质瘤之间阳性率和强阳性率未见显著性差异。表2E P 黼蛋白表达与E G F R 蛋白表达之间的关系K e n d a l l 等级相关分析显示相关系数为0 6 9 8 ，p O 0 5 。表3 髓鼹蛋白表达与P D G F R - a 蛋白表达之间的关系K e n d a l l 等级相关分析显示相关系数为0 2 3 3 , p = 0
10、0 8 7 。4 4表4 各级别胶质瘤中E P S 8 蛋白表达和K i 6 7 指数的关系三。讨论E P S 8 是一种9 7 K d a 的蛋白，其编码基因定位于1 2 q 2 3 2 4 。其结构主要包含N 末端的P T B 域，中间的S H 3 域，以及C 末端与S O S l 和F - a c t i n 结合的S A M P N T域，详见图l 。免疫组化结果显示，E P S 8 蛋白主要分布于细胞膜和细胞浆内，细胞突起和细胞连接处也有丰富的E P S 8 蛋白表达。有报道E P S 8 蛋白在肿瘤细胞内与E R B B 受体家族邻近跨膜段的区域结合。该区域富集的E P S 8 蛋
11、白有助于增强E G F 信号“。同时还有报道指出E P S 8 还常富集于F - a c t i n 束和肌动蛋白结合蛋白构成的细胞膜下网络上，而该结构对于细胞的运动是非常重要的幢。图1E P S 8 蛋白结构示意图12 0 04 0 06O翰嬲翻一掰RB I 喇_ 曰秘叼b n斜线所示E G F R 结合位点位于2 9 6 - - 3 6 2 氨基酸处，S H 3 域可以与A b i I 、R N 疵结合，黑线所示效应区域位于6 4 8 - - 8 2 1 氨基酸处，可以与S o s l 、F - a c t i n 结合。迄今为止，尚未发现有关E P S 8 蛋自在胶质瘤中表达的报道。我们
12、结果显示E P S 8 蛋白表达在W H 0 2 级、W H 0 3 级和W H 0 4 级胶质瘤与正常脑组织之间有显著差异，同样我们在反向点多杂交和R T - P C R 结果中也发现E P S g m R N A 在W H 0 2 级、W H 0 3 级和W H 0 4 级胶质瘤中显著上调，这样在m R N A 和蛋自两个层面证明了胶质瘤中存在E P S 8 高表达。然而由于免疫组化技术量化指标较粗。腔质瘤相关新基因表达研究以阳性细胞数为准；难以排除肿瘤异质性影响和阳性细胞记数上的误差，未能明确显示出E P S 8 蛋白在W H 0 2 级、W H 0 3 级和W H 0 4 级胶质瘤之间
13、的明显差异。统计学分析显示，4 5 例胶质瘤组织中E P S 8 蛋白的表达水平和E G F R 蛋白表达水平呈正相关，相关系数为0 6 9 8 ，p 0 0 5 ；但E P S 8 蛋白表达水平与P D G F Ra 的表达水平未见相关性( 相关系数为0 2 3 3 ，P 为O 1 8 7 ) 。同时E P S 8 蛋白高表达组( + + 和+ + + ) 较低表达组( 一和+ ) K i 6 7 指数显著升高( p o 0 5 ) 。E G F R 受体与肿瘤关系密切，其与配体结合后引起酪氨酸激酶的自动磷酸化，从而通过信号传导系统将信号传递致胞内、核内，改变相关基因的表达和功能，促进肿瘤细
14、胞的增殖、迁移。已有许多报道发现，E G F R 表达与胶质瘤恶性程度里正相关，并且E G F R 高表达的胶质瘤患者预后较差，对放疗也不敏感。E G F R 信号在细胞内的终止主要依靠E G F R 被细胞内吞、降解实现的o 、4 “ 。有试验发现，E P S $ 与R N - t r e 结合后，可以降解R a b 5 G T P 中的G T P ，从而使R a b 5 失活。失活的R a b 5 可以抑制E G F R 受体的内吞，延长受体在膜上的作用时间，从而加强E G F R 信号”。我们发现在胶质瘤中E P S 8 蛋白的表达与E G F R 蛋白表达和K 1 6 7指数呈正相关，
15、说明在胶质瘤中高表达的E P S 8 蛋白有助于延长E G F R 信号持续时间从而加强其信号作用。E P S 8 蛋白除了延长E G F R 信号作用时间外，其本身也是整合多种细胞因子信号的重要信号分子。有证据表明，R P T K 、R A S 、P 1 3 k i n a s e 等信号系统可以通过某种目前尚不清楚的途径促进E P S 8 、s o s l 和A b i l 形成聚合体，聚合体形成后具有R A C G E F 活性。由此将信号传递给R A C 系统，从而引起细胞骨架的重构和j u n 系统的激活，促进细胞分裂、增殖和迁移竹8 。以上过程示意图见彩图2 。还有试验发现，E P
16、 S 8 能直接被V - s r e 磷酸化，其磷酸化程度与V - s r e 转化细胞的增殖能力密切相关。当采用R N A 干扰技术阻断E P S 8 蛋白在V - s r e 转化细胞株中的表达后，细胞株的增殖活性被显著降低了；去除干扰后随E P S 8 蛋白表达的增加，转化细胞株的增殖活性又得到了恢复田。B R O N A 发现在N I H E G F R 细胞中E P S 8 蛋白的酪氨酸磷酸化程度随E G F 刺激信号的强度不断升高，其剂量一反应曲线类似于P L C v ( 一种被认为参与E G F 介导的促有丝分裂活动的E G F R 信号底物) 。同时他还在人类骨肉瘤、膀胱癌、纤维肉瘤细胞株中发现E P S 8 的持续磷酸化现象，在部分肿瘤细胞株中E P S 8 蛋白的磷酸化程度优于P L C Y 、r a s G A P 。4 6胶质瘤相关新基因表达研究他认为，恶性细胞中E P S 8 蛋白被优先磷酸化的现象，说明了该蛋白在
