《扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变》由会员分享，可在线阅读，更多相关《扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、福建师范大学刘燕雅硕七学位论文H R 2 的酶活为4 9 8 U m L ，T m 值为3 9 3 0 C ，比野生型脂肪酶P E L 的提高了0 6 0 C 。测序结果表明：H R 2 突变体脂肪酶基因第2 4 6 位的A 突变为G ，即脂肪酶的第8 2位的L y s ( A A G ) 突变为A r g ( A G G ) ，同时还产生了一个同义突变，第7 9 0 位的T 突变为C ，即编码A l a 的基因由G C T 突变为G C C 。H R 3 的酶活为5 5 2 U m L ，T m 值为4 2 1 0 c ，比野生型脂肪酶P E L 的提高了3 4 0 C 。测序结果表明：H
2、R 3 突变体脂肪酶基因第2 0 4 位的T 突变为C ，即脂肪酶的第6 8位的L e u ( C T C ) 突变为P r o ( C C C ) ；第4 2 6 位的A 突变为G ，即脂肪酶的第1 4 2 位的L y s ( A A G ) 突变为A r g ( A G O ) 。综上，本研究通过定点突变共构建了1 5 个脂肪酶突变体，获得了两株较好的突变体：O P E L e p 8 P 1 9 7 E 的热稳定性在随机突变体P E L e p 8 的基础上，迸一步提高了2 2 0 c ，比野生型P E L 提高了2 8 0 C ，酶活为5 9 2 U m L 。 P E L e p 8
3、 P 1 0 2 L 的热稳定性在随机突变体P E L e p 8 的基础上，进一步提高了2 6 0 C ，比野生型P E L 提高了3 6 0 C ，最适作用温度降低5 0 C ，酶活为6 1 2 U m L 。此外，本研究还通过随机突变获得一株较好的突变体，H R 3 热稳定性比野生型提高了3 4 0 C ，酶活为5 5 2 U m L 。关键词：扩展青霉脂肪酶，定点突变，随机突变，易错P C R 。HA b s t r a c tA b s t r a c tI no r d e rt oi m p r o v et h ee n z y m ep r o p e r t i e so
4、ft h eP e n i c i l l u me x p a a s u ml i p a s e ( P E L ) ，t h eP E Lg e n ew a sm u t a t e db ys i t e - m u t a g e n e s i sa n dr a n d o mm u t a g e n e s i s 1 S i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fP E LI no r d e rt oi m p r o v et h et h e r m o s t a b i l i t yo fP e n i c i
5、 l l i u me x p a n s u ml i p a s e ( P E L ) ，E l e v e nm u t a t i o n sw e r ec r e a t e db ys i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s M u t a t i o n sw e r eg e n e r a t e db yo v e r l a pe x t e n s i o nP C Ru s i n gt h ee D N Ao fw i l d - t y p el i p a s eg e n e ( 1 i p 0 7 ) o
6、 ras i n g l es i t em u t a n tl i p a s ee p 8a st h et e m p l a t ea n dt w os p e c i a lp r i m e r st h a tc o r r e s p o n d i n gt om u t a t i o n s R e c o m b i n a n tv e c t o rw h i c hc o n t a i nm u t a n tg e n e sw a sc o n s t r u c t e da n de l e c t r o p o r a t e di n t oP
7、 i c h i ap a s t e r i sG S115 ( 1 ) P E L P19 7 Es i n g l em u t a n ta n dP E L - e p 8 - P19 7 Ed o u b l em u t a n tD o u b l em u t a n tP E L - e p 8 P19 7 Ew a sc r e a t e db ym u t a t eP r ot oG l ua t19 7b a s e do nt h es i n g l em u t a n tP E L e p 8 T h ed o u b l em u t a n ts h
8、o w sag o o d i m p r o v e m e n ti nt h e r m o s t a b i l i t yw i t haT mo f4 1 5 0 C ，w h i c hi s2 8 0 Ch i g h e rt h a nt h ew i l d - t y p eP E La n d2 2 0 Ch i g h e rt h a ns i n g l em u t a n tP E L - e p 8 P E L - P19 7 Ei sas i n g l em u t a n to fP E La ta m i n oa c i d19 7 T h e
9、T mo ft h i sm u t a n ti s3 9 5 0 Cw h i c hi s0 9 0 Ch i g h e rt h eP E L A f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n ta n dd o u b l em u t a n ta r e5 5 6 U m La n d5 9 2 U m Lr e s p e c t l y I na d d i t i o
10、 n ，t h es u b s t r a t es p e c i f i c i t yo fP E L - e p 8 一P19 7 Ei sc h a n g e d ( 2 ) P E L - K 15 2 Rs i n g l em u t a n ta n dP E L - e p 8 一K 15 2 Rd o u b l em u t a n tD o u b l em u t a n tP E L - e p 8 - K 15 2 Rw a sc r e a t e db ym u t a t eL y st oA r ga t15 2b a s e do nt h es
11、i g n a lm u t a n tP E L e p 8 T h eT mo ft h i sm u t a n ti s3 8 9 0 Cw h i c hi ss i m i l a rt ot h a to ft h ew i l d - t y p ee n z y m e P E L - K 15 2 Ri sas i n g l em u t a n to fP E La ta m i n oa c i d15 2 T h eT mo ft h i sm u t a n ti s3 8 9 0 Cw h i c hi ss i m i l a rt ot h a to f t
12、 h ew i l d t y p ee n z y m e A f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n ta n dd o u b l em u t a n ta r e5 3 0 U m La n d4 1 6 U m Lr e s p e c t l y ( 3 ) P E L - P10 2 Ls i n g l em u t a n ta n dP E L - e p 8
13、一P10 2 Ld o u b l em u t a n tI I I福建师范大学刘燕雅硕士学位论文D o u b l em u t a n tP E L e p 8 一P10 2 LW a Sc r e a t e db ym u t a t eP r ot oL e ua tl0 2b a S e do nt h es i n g l em u t a n tP E L - e p 8 T h ed o u b l em u t a n ts h o w sag o o di m p r o v e m e n ti nt h e r m o s t a b i l i t yw i t
14、haT mo f4 0 9 0 C ，w h i c hi s3 6 0 Ch i g h e rt h a nt h ew i l d - t y p eP E La n d2 6 。Ch i g h e rt h a ns i n g l em u t a n tP E L e p 8 T h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fP E L - e p 8 - P 10 2 Li s4 5 0 C ，5 0 Ch i g h e rt h a nt h a to ft h ew i l d t y p ee n z y m e P E L P10 2
15、 Li sas i n g l em u t a n to fP E La ta m i n oa c i d10 2 A f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n ta n dd o u b l em u t a n ta r e3 0 0 U m La n d612 U m Lr e s p e c t l y ( 4 ) P E L - N16 6 Ds i n g l em u
16、 t a n ta n dP E L - e p 8 - N16 6 Dd o u b l em u t a n tD o u b l em u t a n tP E L - e p 8 N16 6 Dw a sc r e a t e db ym u t a t eA s nt oA s pa t16 6b a s e do nt h es i n g l em u t a n tP E L - e p 8 T h ed o u b l em u t a n ts h o w sr e d u c e di nt h e r m o s t a b i l i t yw i t haT mo f3 6 2 0 C ，w h i c hi s1 1o Cl o w e rt h a nt h ew i l d t y p eP E La n d2 1o Cl o w e rt h a ns i n g l em u t a n t
