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1、高效液相色谱柱的正确使用及维护杨锡祥 (安徽省淮南市药品检验所, 安徽 淮南 232007)关键词: 高效液相; 色谱柱; 维护 随着色谱分析理论和技术的发展, 高效液相色谱仪在分析领域特别是药品分析领域得到了广泛使用, 它是集分离与 检测于一身的分析手段, 其分离的核心部件是色谱柱, 它既是样品组分分离的场所, 又是仪器的一种耗材, 价格昂贵, 正确 的使用, 可在分析数万个以上的样品后仍能保持良好的性能,而不正确的操作, 则可能在一次使用中即告报废 1。因此,对其正确的使用及维护不仅可以保证检测的准确性, 而且还可以最大限度的延长使用寿命, 降低检测成本。 1 高效液相色谱柱的发展现状尽管
2、经过数十年的发展, 出现了各种各样的专用色谱柱, 如制备柱、 分析柱和各种微型柱, 但色谱柱主体上仍由柱体、柱内填料和两端的接头组成。由于使用了高效填料, 并不需 要很长的柱长, 常规分析柱多为 15 30 cm的直型柱。由于高效液相色谱柱要承受系统高压, 所以柱体一般选用金属材 质。大部分色谱柱的接头为通用尺寸, 可互换使用。 目前国内市场上色谱柱供应商很多, 大部分为进口柱或进口填料国内装填柱, 国内自产柱基本上来源于大连依利特 科学仪器有限公司。国外比较知名的品牌有安捷伦公司的Zorbax系列填料柱, W ater公司的 LBondapak系列填料柱, 美 国 Supelco公司的 Su
3、pelco柱, 瑞典 Akzo Nobel公司的 Kro ma -sil填料柱, 迪马公司的 Dia monsil柱以及部分日本岛津公司的 产品, 此外 M erk公司和 M echerey -Nagel公司也是世界知名的色谱填料和色谱柱生产厂家。这些厂家的色谱柱技术成熟, 性能可靠, 但价格较国产柱昂贵的多。较小的厂家生产的色谱柱基本上是购买填料自行装填而成, 由于装填技术的差别, 性能上有一定差距。2 影响色谱柱使用寿命的主要因素 2. 1 流动相因素2. 1 . 1 流动相 p H 不同基质的填料具有不同的 pH适用范 围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为 100 mg#L- 1,
4、且在 pH 1 9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量, 考虑 到溶解速度的影响, 对于硅胶基质的填料, 其所能承受的流动 相 pH 范围约为 1 8 2。键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用, 使填料对流动相的适应范围大大增加, 如现在广泛使 用的反相色谱填料 C1 8(十八烷基硅烷键合硅胶 ), 其 pH适用范围可达 2 10。当流动相 pH值超出酸性范围时, 键合相易 发生水解而流失; 当流动相 pH超出碱性范围时, 会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子, 这两种反应均是不可逆反 应, 特别是在温度较高 ( 40e)的环境下, 会使柱效迅速降低而报废。 2. 1 . 2 流动相变质 当前使用
5、最为广泛的是硅基键合相填料, 当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸 盐缓冲液时, 水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或 霉菌, 从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动比例混合的高效液相色谱仪来说, 水相或缓冲盐相独立存贮,因存放时间较长而容易发生此类问题。 2 . 1 . 3 流动相纯度 目前广泛使用的填料颗粒粒径范围在3 10 Lm, 孔径在 6 10 nm, 色谱柱在使用中会有大量的流 动相通过, 如流动相含有微量不溶性杂质颗粒, 则很容易在柱头部位被截留, 久而久之, 造成色谱柱机械性堵塞, 引起柱压 升高而无法正常使用。2 . 1. 4 其它因素 如流动相的极性
6、对柱子也有一定影响, 甲 醇、 水、 冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱, 正丁醇、二氯甲烷等极性小的物质会破坏化学键合硅胶柱, 碱性溶液 会破坏阳离子交换树脂色谱柱, 酸性溶液容易损坏阴离子交 换树脂柱3。2 . 2 样品因素 2 . 2. 1 样品的溶解性 样品试样在配制中, 如有少量微粒未能完全溶解, 则会随试样一起进入色谱柱, 同样会沉积在柱头 处, 造成色谱柱的堵塞。2 . 2 . 2 样品的纯度 样品中可能含有待分析组分以外的各 种组分或杂质, 这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸附, 从而使固定相的活性点被覆盖, 保留特性发生变化。 2 . 2 . 3 样品的化学性质 待测
7、试样中的各种组分与填料之 间应具有化学稳定性, 比较典型的是在使用氨基键合柱时, 应避免使用含羰基的化合物和流动相, 如丙酮、 乙酸乙酯等, 以 免固定相中的 NH2和酐、 酮发发希夫 ( Schiff)缩合而使固定相破坏3。2 . 3 其它因素 影响色谱柱寿命的因素很多, 除流动相和样 品因素外, 还有其它一些外在因素, 如柱压的影响, 温度的影响, 色谱柱的正确冲洗, 色谱柱的正确安装等。 3 高效液相色谱柱的正确使用3 . 1 加装保护柱 保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样 品的化学/ 拉圾0同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、 进样阀后部以及 在色
8、谱柱的两端都装有 1、2 Lm 等不同孔径的滤器, 但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然, 因此, 加装保护柱 是必要的, 特别是在分析中药、 中成药等复杂混合物和生物样 品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析柱一致, 粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品, 经过一定次数 的样品分析 ( 50 100次 )后, 出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时, 应考虑更换保护柱。 3 . 2 过滤流动相和样品 流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成, 原则上, 所有经过色谱柱的流动相均应过 滤, 但在实际操作上应视具体情况而有所区别: 当有机溶剂用色谱纯级, 水用石英亚沸水或其它超
9、纯水时, 在能确保水和有 机溶剂的质量且没有受到污染时, 过滤并无更多实际意义。当流动相中含有缓冲盐时, 则过滤是必要的, 如前所述, 当缓 冲溶液放置一段时间 (视环境温度不同而异, 夏季一般不超 过 48 h, 冬季一般不超过一周 )后, 在使用前还应重新过滤。所配制的样品试液在注入流路系统前均要经 0. 45 Lm( 0 . 22#626#安 徽 医 药 AnhuiM edical and Pharmaceutical Journal 2006August ; 10( 8)Lm则更好 )孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系, 二者不 可混用, 以防止滤膜溶解而造成污染。装流动相的容器和色谱
10、系统中的在线滤器要定期清洗和更换, 以避免滤器因过载 而起不到过滤作用。3. 3 净化样品 当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分, 如产生永久性吸附的蛋白质、 糖等有机分子和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽 可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。3. 4 避免过高的柱压 虽然高效液相色谱柱能耐受的压力 可达 6000 psi(磅 /平方英寸 ), 但过高及过大的压力变化均会 缩短色谱柱的寿命, 避免的方法是 ( 1)柱压过高时, 尽可能采用较小的流速, 以不超过柱最大允许压力的一半为宜。 ( 2) 当流速较大时, 应采取流速梯度的办法使流速分步到位。( 3
11、)使用手动进样阀时, 进样阀的切换要尽可能的快。否则 超过 20 % 的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,柱切换要避免在高压下进行。 3. 5 注意温度和酸碱度 一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过 60e , 以低于 40e 为宜, 特别是在流动相 pH 接近使用限度时, 更应降低使用温度。温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解, 从而使填料性质改变, 柱床塌陷, 降 低柱效, 改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的 pH适用范围可达 2 10, 但在实际使用时应避免极端的 pH 条件, 特 别是在偏碱性的条件 ( pH 8)下使用 4, 如必须要在极端的pH条件下使用时, 可通
12、过以下方法避免柱损害: ( 1)在泵和 进样阀之间加装预柱 (饱和柱 )来饱和流动相 ( 2)降低使用温度 ( 3)检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的/ 温 和溶剂0彻底清洗。3. 6 正确及时的冲洗 开始试验前, 应了解柱中当前是何种 溶剂。对于新色谱柱, 如无特殊说明均为评价报告中所用流动相 4。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶, 要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。异丙醇是唯一能与各种溶剂混溶的试剂, 可作为中介流动相 使用。反相键合硅胶柱适宜的保存环境是纯甲醇, 如分析用流动相为缓冲液- 有机溶剂, 可先用较低甲醇含量 ( 20 % )的 甲醇- 水置
13、换掉原来的纯甲醇, 再进分析用流动相, 以防止在柱内发生盐的沉淀; 试验结束后, 要及时用适当的溶剂冲洗系 统并最终过渡到纯甲醇冲洗, 对于含有缓冲盐的流动相, 最好的办法是先用与分析用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的 溶液进行冲洗, 再逐步过渡到纯甲醇冲洗。多数报道冲洗液体积大约为柱容积的 15 20倍, 但最终要以基线是否平直、 压力是否稳定决定。有些厂家的色谱柱标明了流动相中有机相的最低使用浓度为 5% , 使用时应给予注意。 4 高效液相色谱柱的维护4. 1 柱的安装与拆卸 色谱柱属易耗品, 需要不断更换。高 效液相色谱柱的安装是一项经验性很强的工作, 在安装之前一定要仔细清洁密封卡套
14、和接头端面, 不能残留固体颗粒。 要保证管道端面与柱头端面的良好结合, 不能留有死体积。接头等组件不要拧的过紧, 适当上紧后开机试验, 以恰好不泄 漏为宜, 防止用力过大而导致管道变形或用力不足而发性泄漏, 若用力过大锥形卡套已将管道挤压变形, 可将管道前端连 同卡套切割掉, 再用金钢锉小心磨平端面, 洗净锉屑和毛刺后 重新连接。目前多数在用高效液相色谱仪柱前流路系统为金属材质, 柱接头采用固定板手紧固, 在紧固螺母时不要一下用 力过猛, 防止锥形卡套卡死在阴接头内无法取出。为避免这种现象, 有些厂家 (如安捷伦公司 )已使用有固 定接头的 PEEK 管代替金属管, 用手动紧固代替板手紧固,
15、但要特别注意接头尺寸 (口径和接口深度 )的匹配。大连物化所色谱中 心生产的一种通用接头可适用于不同内径的管道, 而且采用手动紧固, 非常方便。即使不同厂商标示的接头规格相同, 也 最好使用同一厂家的色谱柱和接头, 以确保连接的可靠性。柱后端为低压连接, 无论板连接还是手动连接, 稍用力即可保 证不漏。 4 . 2 柱污染的处理 常见的柱污染有柱头烧结滤板堵塞、 柱头内填料污染和柱内有盐结晶析出。柱污染的常见症状是柱 压突然升高及出现鬼峰, 简单的处理是选择能溶解污染物的流动相, 将色谱柱反接后进行冲洗, 冲洗时柱出口端与检测器 断开以防污染检测器, 冲洗液体积约为 20 30倍色谱柱容积。对
16、于一些保留强的污染物, 如脂类可用四氢呋喃、 乙腈或 甲醇冲洗; 蛋白质类可用乙腈、 丙醇和 1% 三氯乙酸进行梯度洗脱; 高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脱。另外, 有些文献 提出了各种填料色谱柱的再生方法 5, 可参照使用。上述方法无效时, 可尝试拆洗烧结滤板或挖补柱头处填 料的方法处理, 但这两种方法都需打开柱头, 会破坏柱床的整体均匀性, 一般不轻易使用。当确定是柱内盐结晶析出时, 可 用纯水或低甲醇含量 ( 5% )的甲醇- 水混合液冲洗至基线稳定。 4 . 3 柱塌陷的处理 色谱柱经一段时间使用后, 特别是流动相压力变化过大或酸碱度不当时, 会发性柱头塌陷, 使峰形异 常 (分岔 )。其处理方法是打开柱头, 拆下烧结滤器, 用工具小心刮平柱床端面 (可同时除去少量柱头被污染的填料 ), 用 甲醇与填料混合成均浆液, 将均浆液滴在柱头上, 靠重力排除甲醇液, 直到柱头凹陷处平整, 再小心复原柱头。带有柱套的 色谱柱柱端烧结滤器是镶嵌在柱端封口塑料塞的内侧, 封口塑料塞直接挤压进柱管, 在拆卸时, 应从侧面用金
