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1、脱氧三磷酸尿苷C L P盲肠结扎穿孔术L P S脂多糖T N F a肿瘤坏死因子一a缩略词表R A S肾素一血管紧张素系统A G T血管紧张素原A C E血管紧张素转换酶T P K酪氨酸蛋白激酶A n g l I血管紧张素I IN R l D l胞内型糖皮质激素受体I l 1 b白细胞介素一1 8M A L淋巴细胞学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人郑重声明：所早交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标
2、明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名( 手写) ：Z 矗当日导师签名( 手写k = 垂三三秀 一叫日学位论文版权使用授权二f ；本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)作者签名。手写，：瑚p 吉年j 1 日
3、导师签名。手写页- 三三二篓汐矽玩年碑脓毒症大鼠心脏组织基因表达变化的研究 摘要目的应用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠心脏组织细胞基因表达谱的变化。方法雄性W i s t a r 大鼠3 0 只，随机分为模型组和空白对照组，每组1 5 只。采用盲肠结扎穿孔术( C L P ) 制备大鼠脓毒症模型，以心脏组织的透射电镜检查鉴定模型。应用含有2 2 5 2 3 个大鼠基因c D N A 克隆的表达谱基因芯片，取R a t i o 均数( R a t i oA v e r a g e ，R A ) 2 及R A 2o rR A 2 0 或均 3 8 。C 或 9 0 次m i n ，呼吸 2 0 次
4、m i n或P a C 0 2 1 2 i 0 9 L 或 1 0 ；满足上述两项，并排除其他已知原因的急性改变，可诊断为S I R S 佃。病原微生物( 细菌、病毒或真菌) 能刺激单核细胞分泌白介素一1 ( I L 一1 ) 、白介素一6 ( I L 一6 ) 肿瘤坏死因子一a ( T N FQ ) ，这些细胞因子随后调节一系列其他因子的释放，如白介素一8 ( I L - 8 ) 、补体、组胺、激肽、5 一羟色胺、选择蛋白、花生四烯酸类代谢产物、中性粒细胞等，这些因子的激活就会导致局部血管扩张( 以后会因一氧化氮的释放进一步加强) 、释放多种细胞毒性化合物，产生失控的全身炎症反应。同时脓毒症
5、可诱发淋巴细胞( 以B 细胞、C D 4 + 细胞为主) 、树突细胞的加速凋亡，并削弱单核细胞的抗原递呈作用，引发了特异性免疫功能的抑制伸，而非特异性免疫炎症反应却呈亢进状态，前列腺素E ：( P G E ：) 、白介素一4 ( I L 一4 ) 、白介素一1 0 ( I L - I O ) 、转化生长因子- B I ( T G F - B I ) 等抗炎性细胞因子n 及抗炎性内分泌激素如糖皮质激素等的分泌也增加，形成代偿性抗炎反应综合征( C A R S ) 。S I R S 与C A R S 之间的平衡失调，产生了逐级放大的连锁瀑布式反应，导致凝血功能紊乱“及微循环和组织灌注的严重障碍，进
6、而损伤组织、器官的功能，是严重脓毒症的主要病理生理变化“鼢。促炎性因子与抗炎性因子的基因表达水平与S I R S及脓毒症的发生和严重程度相关o 。有关脓毒症发生发展机制的研究虽已取得了很多进展，但其确切的分子机制目前仍不清楚。3 基因芯片技术在研究脓毒症分子作用机制中的应用脓毒症的发生、发展涉及众多细胞因子和趋化因子，在机体内既存在着促炎反应，又存在着抗炎反应，影响两者平衡的因素错综复杂，与基因多态性及基因表达调控密切相关“耵。利用基因芯片技术筛选在炎性细胞活化过程中的多个环节上起作用的分子和起关键性调控作用的基因，揭示炎性细胞活化在脓毒症发生、发展过程中的作用，对于脓毒症的本质认识及其治疗具
7、有重要的意义。李明强等n 采用含有2 2 0 1 个小鼠e D N A 克隆的基因芯片，在小鼠盲肠结扎一穿孔术( C L P ) 后混合感染性脓毒症模型上检钡U C L P 后早期( 6h ) 和晚期( 1 2 h ) 肺组织中的差异表达基因。初步显示了脓毒症肺组织中部分基因表达的特征性改变：在脓毒症小鼠的肺组织中，免疫及抗感染反应、促炎性与抗炎性反应和急时相反应相关基因的表达均有明显上调；与脓毒症早期小鼠相比，晚期脓毒症小鼠肺组织中基因表达的改变更为广泛，除与免疫反应、急时相反应相关基因的表达上调外，对细胞损伤有重要保护作用的细胞热休克反应基因、抗氧化反应基因的表达在此期出现明显下调，同时伴
8、有一系列与细胞能量代谢、药物代谢与解毒、骨架蛋白、基因转录、蛋白合成和细胞分裂功能有关的基因表达的抑制。李志军等“6 采用含有4 0 9 6 个大鼠c D N A 克隆的基因芯片，检测C L P 混合感染性脓毒症模型大鼠晚期( 2 4 h ) 肝组织中的差异表达基因，初步显示脓毒症肝组织中部分基因表达的特征性改变：各种基本生化物质代谢酶类基因和能量代谢相关基因1 1 6 条，其中9 2 条基因表达下调，只有2 4 条基因表达上调，如三磷酸腺昔柠檬酸盐裂解酶、鼠葡萄糖- 6 - 磷酸酶、L 型丙酮酸激酶、细胞色素P 4 5 0 、电子转移黄素蛋白这些基因的表达量都发生了下调，说明机体处于一种低物
9、质代谢和能量代谢的衰竭状态。免疫相关基因中，免疫球蛋白的重链表达量、聚合体的免疫球蛋白受体表达量均下调，但是T N F a 转换酶、白细胞介素一lB ( I L 一19 ) 、Y一干扰素受体等炎症介质的表达量均上调，显示出机体出现免疫系统功能紊乱，且处于免疫炎症状态。血液相关基因中凝血因子X I I 表达量虽有下调，但是玻璃粘连蛋白、纤维蛋白原、组织因子途径抑制剂等基因表达量上调，说明血液处于高凝状态；而其他急性时相反应基因表达量的上调是机体对更多自由基攻击的一种应激表现。癌基因相关基因中，抑癌基因表达量下调，癌基因表达量上调；生长因子基因肌营养素表达上调，应激反应类基因表达上调，这是细胞应对
10、衰竭状态的一种保护性反应，同时这些反应可能是造成机体病变进行性发展的原因。细胞凋亡的抑制因子表达量下降，推测可能是脓毒症损伤进行性加重，进而导致多器官功能衰竭( M O F ) 的原因。C o b b 等7 用雄性C 5 7 B L 6 小鼠经C L P 制作脓毒症动物模型，以含有5 8 8 个小鼠基因的微阵列来检测其脾和肝的基因表达，发现了多种基因表达上调或下调，并且这些基因的变化具有器官特异性，脓毒症组小鼠肝与脾的基因表达谱重叠极少。与对照组相比，脾有6 9 种基因、肝有5 8 种基因的表达变化具有统计学差异，其中促炎基因N F 2 k b 、P 1 0 5 、氧应激基因G S H 转移酶
11、、热应激基因H S P 6 0 和凋亡基因F a s L 等，在脾和肝的表达比例相差2 倍以上。此外，聚类分析显示C L P 术2 4 d , 时后可诱导基因的协同表达，改变脾组织细胞的信号传导和存活路径，与以往有关脓毒症动物模型脾组织细胞凋亡的研究报告相一致。C h i n n a i y a n 等“用含有7 3 9 8个小鼠基因的微阵列检钡q C L P 术后脓毒症模型小鼠的重要脏器基因表达，结果亦显示小鼠的胸腺及脾组织基因表达谱均有特异性；同时，促炎性因子与抗炎性因子的基因也都有不同程度的表达。李磊等“们则采用可较好反映炎症全貌的血白细胞作为研究目标，通过将5 0只C 5 7 B L
12、6 J 小鼠随机分为脓毒症模型组( 7 = 2 5 ) 和正常组( 门= 2 5 ) ，腹腔内注射脂多糖( L P S ) 制备小鼠脓毒症模型，应用含1 2 4 8 9 条小鼠全长基因的寡核苷酸芯片分别检测脓毒症小鼠和正常小鼠血白细胞的基因表达谱，以R a t i o 均数( R A ) 3 及R A 一3 的基因为脓毒症表达差异基因，分析表达差异基因与脓毒症之间的关系。研究结果显示：转录因子基因K l f 5 、C E B P1 3 上调最为显著，其中K l f 可调控多种生长因子及细胞因子的转录，显著上调可能会削弱机体免疫功能；C E B P1 3 可在多种类型细胞中被L P S 及细胞因
13、子调控2 ，可能在脓毒症诱发中起到重要作用。脓毒症的信号转导基因除T P K 信号通路基因( M a p 3 k 8 、H c k 、I Il r 2 、I Il m ) 表达上调外，还可见G 蛋白介导的信号转导途径基因L t b 4 r l 、C c r 5 、F p r l 、1i g p 2 p e n d i n g 、S o c s 3 、S o c s l 表达增加，其中以C c r 5 的R a t i o 值最高。除炎性因子、蛋白酶、黏附分子等促炎性基因高表达外，亦有多个促细胞凋亡基因明显上调。提示脓毒症小鼠基因变化的机制模式可能为：炎症信号激活T P K 信号通路及G 蛋白介
14、导的信号转导途径，进一步活化K lf 5 、c E B P1 3 等转录因子，从而促发相关基因表达。尽管细菌种类极其庞大，但它们具有共同的结构特点。革兰阳性菌都具有脂多糖( L P S ) 结构，革兰阴性菌都具有肽聚糖( P G N ) 、脂磷酸( L A T ) 。它们作用的主要靶细胞是单核细胞，通过其表面C D l 4 和T o l1 样受体( T L R s ) ，经过M y D 8 8 将信号传入胞核内，启动相关基因的转录。A n t h o n y 等2 2 用基因芯片实现了对细菌的快速诊断。H e l l e r 等2 将与炎症相关的细胞因子、趋化因子D N A 结合蛋白的相关基因
15、探针分布于9 6 个位点上制成炎症芯片，用炎症患者组织m R N A 及细胞c D N A 进行芯片杂交，取得了不同原因炎症中相关基因的变化情况及新基因的信息，使人们获得了有关炎症的病因、病程和药物治疗等相关信息。W a n g 等他们用c D N A 微阵列观察葡萄球菌肽聚糖和内毒素刺激下人单核细胞系的基因表达变化，发现在6 0 0 个被检测基因中有1 2 0 个基因表达上调，表达变化最明显的是趋化因子基因，如I L 一8 、巨噬细胞炎性蛋白lQ ( M I P - 1a ) ，而细胞因子T N F - a 、I L - 1 和I L - 6 的基因表达也上调，但其程度次于前者。由于脓毒症复
16、杂的病理生理变化及临床的治疗干预，仅在单个时点上进行的基因芯片检测分析其结果仍有一定的局限性2 ”，如能进一步对基因产物进行多时点检测，将有助于更加全面地了解脓毒症的发生、发展规律。4 小结由于促炎性因子与抗炎性因子的产生及相互作用构成了脓毒症的主要发生、发展机制，而它们的基因多态性数量众多、表达调控机制错综复杂，故直到现在仍难以完全阐明脓毒症的发病机制，严重影响了脓毒症的临床治疗效果。基因芯片技术可以通过大量寡核苷酸探针大规模地检测样品的基因序列及表达信息，为脓毒症分子机制的研究及临床治疗开辟了新途径。已有国内、外学者利用小鼠盲肠结扎一穿孔术( C L P ) 或腹腔内注射脂多糖( L P S ) 制备的小鼠脓毒症模型，采用基因芯片技术对其肺、肝、脾等组织及血白细胞的基因表达进行了研究，其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变，主要包括多种与全身炎症反应、信号传导、细胞凋亡有关的基因表达出现上调或下调。虽然基因芯片技术尚存在不少问题，目前难以大规模
